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GB 5009.211-2022

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基本信息
标准编号 GB 5009.211-2022 (GB5009.211-2022)
中文名称 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定
英文名称 National Food Safety Standard - Determination of folates in food
行业 国家标准
中标分类 X09
字数估计 12,141
发布日期 2022-06-30
实施日期 2022-12-30
旧标准 (被替代) GB 5009.211-2014
归口单位 国家健康卫生委员会
发布机构 国家市场监督管理总局

GB 5009.211-2022: 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定
GB 5009.211-2022 英文名称: National Food Safety Standard - Determination of folates in food
书中华人民共和国国家标准
GB 5009.211-2022
1 范围
本标准规定了食品中叶酸的测定方法。
本标准适用于食品中叶酸的测定。
5 菌种的制备与保存
5.1 菌种
5.2 储备菌种的制备
将菌种鼠李糖乳杆菌转接至菌种储备用琼脂培养基中,在36℃±1℃恒温培养箱中培养20h~
24h,连续传种2代~3代。取出后放入2℃~4℃冰箱作为储备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至菌种储备用琼脂培养基中,在36℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h以活化菌株,用于接种液的制备。
注:保存2周以上的储备菌种,不能立即用作接种液制备,实验前宜连续传种2代~3代以保证细菌活力。
5.3 接种液的制备
实验前一天,取2mL叶酸标准工作液与4mL叶酸测定用培养基混匀,分装至2支试管中,于
121℃ (0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌15min(或根据培养基标签标识进行灭菌)后即为种子培养液。
冷却后用接种环将活化的菌株转种至2支种子培养液中,于36℃±1℃恒温培养箱中培养20h~
24h。取出后将种子培养液混悬,无菌操作下吸取0.5mL转种至5mL不加叶酸标准工作液的无菌叶
酸测定培养基中,于36℃±1℃再培养6h,以消耗种子培养液中残存在菌株中的多余叶酸,制成接种液。
6 分析步骤(所有操作均需避光进行)
6.1 试样制备
谷物类、豆类、乳粉等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);肉、蛋、坚果等用均质
器制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀,也可采用冷冻干燥粉碎法混匀;液体试样用前振摇混
合。上述制备的试样于2℃~4℃冰箱可保存1周。
6.2 试样提取
6.2.1 直接提取法
测定样品中添加的叶酸含量时,可采用直接提取法。
准确称取固体试样0.1g~2g或液体试样0.5mL~2mL,精确至0.001g,转入锥形瓶中,加入
80mL氢氧化钠乙醇溶液,具塞,超声振荡0.5h~4h至试样完全溶解或分散,转入100mL容量瓶中,用水定容至刻度。
6.2.2 酶解提取法
谷薯类、肉蛋乳类、果蔬菌藻类、豆类及坚果类等食品试样中天然存在的叶酸宜采用酶解提取法。
准确称取适量试样(含0.2μg~2μg叶酸),精确至0.001g。一般谷薯类、肉类、乳类、新鲜果蔬、菌藻类试样2g~5g;蛋类、豆类、坚果类、内脏、干制试样0.2g~2g;流质或半流质试样5g~10g。转入
100mL锥形瓶中,加30mL磷酸盐缓冲液,振摇5min后,具塞,于121℃(0.10MPa~0.12MPa)高压水解15min。
试样取出后冷却至室温,加入1mL鸡胰腺溶液、1mL蛋白酶-淀粉酶液,混合。加入3滴~5滴甲
GB 5009.211-2022
苯后,置于36℃±1℃恒温培养箱内酶解16h~20h。取出,转入100mL容量瓶,加水定容至刻度,过滤。
另取一只锥形瓶,不加试样,其他步骤同试样操作,作为酶空白液。
注:以谷物、乳粉等为基质的配方食品如需计量基质本底叶酸含量,可采用酶解法提取。
6.3 稀释
根据试样中叶酸含量用水对试样提取液进行适当稀释,使试样稀释液中叶酸含量在0.2ng/mL~
0.3ng/mL范围内。
6.4 试样测定
6.4.1 试管法
6.4.1.1 试样和酶空白系列管
取3支试管,分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL试样稀释液(犞狓),补水至5.0mL,混匀。另取3支
试管同法加入酶空白液。每个梯度做2个平行。
6.4.1.2 标准系列管
取试管分别加入叶酸标准工作溶液0.00mL、0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、
2.50mL、3.00mL、4.00mL和5.00mL,补水至5.00mL,相当于标准系列管中叶酸含量为0.00ng、
0.05ng、0.10ng、0.20ng、0.30ng、0.40ng、0.50ng、0.60ng、0.80ng和1.00ng,混。制备2套~3套
标准系列管,绘制标准曲线时,以每个标准点平均值计算。
6.4.1.3 灭菌
将所有测定系列管、叶酸测定培养基于121℃(0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌15min(或根据培养基要求进行灭菌)。
6.4.1.4 接种和培养
待测定系列管冷却至室温后,在无菌操作条件下,每10mL叶酸测定培养基加入接种液40μL,混匀,每支测定管中加入接种后的叶酸测定培养基5mL,混匀。置于36℃±1℃恒温培养箱中培养20h~
40h,获最大混浊度时终止培养。另准备一支标准0管(含0.00ng叶酸)不接种作为0对照管。
6.4.1.5 测定
将培养好的标准系列管、试样和酶空白系列管用漩涡振荡器混匀。用1cm比色杯,于540nm处,
以未接种0对照管调节透光率为100%(或吸光度值为0),依次测定标准系列管、试样和酶空白系列管
的透光率(或吸光度值)。如果0对照管出现浑浊,说明可能有杂菌污染,需重做实验。
注:适宜的测定光谱范围为540nm~610nm。
6.4.2 微孔板法
6.4.2.1 试样系列管
先将6.3试样稀释液无菌条件下用无菌水相滤膜(0.22μm)过滤除菌,取3支1.5mL无菌离心管,分别加入100μL、200μL、300μL试样稀释液,补无菌水至500μL。每个梯度做2个平行。
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6.4.2.2 标准系列管
按6.4.1.2中标准溶液的制备方式,体积按比例缩减至1.0mL后,在无菌条件下过滤除菌至无菌离
心管中。制备2套~3套标准系列管,绘制标准曲线时,以每个标准点平均值计算。
6.4.2.3 接种和培养
叶酸测定培养基高压灭菌冷却后,每10mL培养基中加入菌种接种液40μL,混匀,吸取150μL加入微孔板中。另吸取150μL标准系列管或试样系列管加入微孔板中,覆膜,混匀,置于36℃±1℃恒温培养箱中培养32h~40h。
6.4.2.4 测定
混匀微孔板中培养物,用酶标仪在540nm处测定吸光度值。
如果0对照孔出现浑浊,说明可能有杂菌污染,需重做实验。
注:适宜的测定光谱范围为540nm~610nm。
7 分析结果表述
7.1 标准曲线
以标准系列管叶酸含量为横坐标,每个标准点透光率(或吸光度值)均值为纵坐标,绘制标准曲线。
7.2 试样结果计算
从标准曲线计算试样或酶空白系列管中叶酸的相应含量(犮狓),如果3支试样系列管中有2支叶酸
含量在0.10ng~0.80ng范围内,且各管之间折合为每毫升试样提取液中叶酸含量的偏差小于10%,则
可继续按式(1)、式(2)、式(3)进行结果计算,否则需重新取样测定。
8 精密度
一般食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%;营养
素补充剂和强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
9 其他
试管法:果蔬类试样称样量为5g时,检出限为0.2μg/100g,定量限为0.4μg/100g;蛋白质、淀粉含量高的试样称样量为5g时,检出限为1.0μg/100g,定量限为2.0μg/100g;营养强化剂和强化食品称样量为1g时,检出限为0.5μg/100g,定量限为1.0μg/100g。微孔板法:添加了叶酸的样品,称样量为1.0g,稀释倍数为1时,
附 录 A
培养基配制
A.1 菌种储备用琼脂培养基
A.1.1 试剂
A.1.1.1 磷酸氢二钾(K2HPO4)。
A.1.1.2 三水合磷酸二氢钾(KH2PO4·3H2O)。
A.1.1.3 七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)。
A.1.1.4 七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)。
A.1.1.5 一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)。
A.1.1.6 三水合乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。
A.1.1.7 葡萄糖(C6H12O6)。
A.1.1.8 蛋白胨:含氮量≥10%。
A.1.1.9 酵母提取物(干粉):含氮量≥10%。
A.1.1.10 琼脂。
A.1.1.11 盐酸溶液(1mol/L):量取83.3mL盐酸(浓度36%~38%),用水定容至1000mL,混匀。
A.1.2 试剂配制
A.1.2.1 甲盐溶液:分别称取25g磷酸氢二钾和25g三水合磷酸二氢钾,加水溶解并定容至500mL,
混匀。加入1mL甲苯,混匀;该溶液于2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.1.2.2 乙盐溶液:分别称取10g七水合硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g七水合硫酸亚铁和0.5g一水合
硫酸锰,加水溶解并定容至500mL。加5滴1mol/L盐酸溶液,混匀;该溶液于2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.1.2.3 菌种储备用琼脂培养基:按表A.1称量或吸取各试剂,加水至100mL,混合,沸水浴加热至琼
脂完全溶化。趁热用1mol/L盐酸溶液或1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.1。尽快分装,根
据试管内径粗细加入3mL~5mL,液面高度不得低于2cm。121℃(0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌
15min。试管取出后直立放置,待冷却后于2℃~4℃冰箱内保存,备用。
A.2.2.3 酪蛋白液:称取50g去维生素酪蛋白于500mL烧杯中,加200mL盐酸溶液,于121℃
(0.10MPa~0.12MPa)高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内,在沸水浴上蒸发至膏状。加200mL
水使之溶解后再蒸发至膏状,如此反复3次,以除去盐酸。用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5±0.1。
加20g活性炭,振摇约20min,过滤。重复活性炭处理直至滤液呈淡黄色或无色。滤液加水稀释至
1000mL,加1mL~3mL甲苯,于2℃~4℃冰箱可保存1年。
注:每次蒸发时不可蒸干或焦糊,以避免所含营养素破坏。也可直接购买效力相当的酸水解无维生素酪蛋白。
A.2.2.4 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液:分别称取硫酸腺嘌呤、盐酸鸟嘌呤以及尿嘧啶各0.1g于250mL
烧杯中,加75mL水和2mL盐酸,加热使其完全溶解后冷却。若有沉淀产生,再加盐酸数滴,加热,如
此反复直至冷却后无沉淀产生为止,加水至100mL。加3滴~5滴甲苯,储存于棕色试剂瓶中,于2℃~4℃ 冰箱可保存1年。
A.2.2.5 黄嘌呤(C5H4N4O2)溶液:称取0.4g黄嘌呤,加10mL氨水,加热溶解,加水至100mL。加
3滴~5滴甲苯,储存于棕色试剂瓶中,于2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.2.2.6 乙酸缓冲液(1.6mol/L,pH4.5):称取63g三水合乙酸钠,用200mL水溶解,加大约20mL冰乙酸调节pH至4.5±0.1,混合后,用水稀释至500mL。
A.2.2.7 维生素液:称取100mg核黄素用400mL乙酸缓冲液溶解。取25mg碳酸氢钠溶解于
500mL水中,加入2mg生物素、200mg对氨基苯甲酸、400mg盐酸吡哆醇、40mg盐酸硫胺素、80mg
泛酸钙、80mg尼克酸溶解。将上述两种溶液混合,加水至1000mL。加入3滴~5滴甲苯,储存于棕
色试剂瓶中,于2℃~4℃冰箱可保存1年。
A.2.2.8 聚山梨酯-80溶液(吐温-80):将10g聚山梨酯-80溶于无水乙......
   
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