搜索结果: GB/T 20190-2025, GB/T20190-2025, GBT 20190-2025, GBT20190-2025
| 标准编号 | GB/T 20190-2025 (GB/T20190-2025) | | 中文名称 | 饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定 | | 英文名称 | Determination of bovine, ovine and goat-derived materials in feeds | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B46 | | 国际标准分类 | 65.120 | | 字数估计 | 15,172 | | 发布日期 | 2025-06-30 | | 实施日期 | 2026-01-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 20190-2006 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 20190-2025: 饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定
ICS 65.120
CCSB46
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 20190-2006
饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定
2025-06-30发布
2026-01-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替GB/T 20190-2006《饲料中牛羊源性成分的定性检测 定性聚合酶链式反应(PCR)
法》,与GB/T 20190-2006相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
a) 更改了适用范围和检出限(见第1章,2006年版的第1章);
b) 增加了“缩略语”一章(见第4章);
c) 增加了“实时荧光聚合酶链式反应法”一章(见第5章);
d) 更改了聚合酶链式反应(PCR)法的原理、试剂与材料、DNA提取方法、PCR检测方法、结果判
定和表述,增加了质量控制(见第6章,2006年版的第3章、第4章、第6章、第7章);
e) 增加了“实验室污染防治措施”一章(见第7章);
f) 增加了“危害性废弃物处理”一章(见第8章);
g) 增加了牛、绵羊、山羊PCR检测内参对照基因及靶基因序列(见附录B)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。
本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新希望六和股份有限公司。
本文件主要起草人:潘良文、蔡一村、张语秋、韩伟、杨青、张晨、邵冰玉、许镇坚、宁雪、吕游。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2006年首次发布为GB/T 20190-2006;
---本次为第一次修订。
饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的测定
1 范围
本文件描述了饲料中牛、绵羊和山羊源性成分的实时荧光聚合酶链式反应和聚合酶链式反应的检
测方法。
本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、饲料原料、复合预混合饲料和混合型饲料添加剂中
牛、绵羊和山羊源性成分的检测。
本文件的检出限为0.1%。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
GB/T 35918-2018 动物制品中动物源性检测基因条码技术Sanger测序法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
Ct:循环阈值(cyclethreshold)
5 实时荧光聚合酶链式反应法
5.1 原理
根据牛β-actin 基因、绵羊催乳素受体基因和山羊9号染色体基因的特异性序列设计引物和探
针,采用实时荧光PCR技术进行扩增,依据扩增反应中产生的荧光信号和Ct值实现对牛、绵羊和山羊
源性DNA成分的检测。
5.2 试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。
5.2.1 水:GB/T 6682,一级。
5.2.2 2×实时荧光PCR预混液:含有TaqDNA聚合酶、实时荧光PCR缓冲液、MgCl2 和dNTPs等
成分,不应含有牛血清白蛋白。
5.2.3 氢氧化钠溶液(10mol/L):称取400g氢氧化钠,加水定容至1L。
5.2.4 Tris-盐酸溶液(1mol/L):称取121.1gTris溶解于800mL水中,用盐酸调pH至8.0,加水定容
至1L。在103.4kPa、121℃灭菌20min,室温保存。
5.2.5 EDTA溶液(0.5mol/L):称取186.1gNa2EDTA·2H2O 溶解于800mL水中,磁力搅拌器上
剧烈搅拌,加入氢氧化钠约20g,再滴加氢氧化钠溶液(5.2.3)调pH至8.0,定容至1L,在103.4kPa、
121℃灭菌20min,室温保存。
5.2.6 Tris-EDTA(TE)缓冲液:分别量取10mLTris-盐酸溶液(5.2.4)和2mLEDTA溶液(5.2.5),加
水定容至1L,混匀,在103.4kPa、121℃灭菌20min,备用。
5.2.7 引物和探针:用 TE缓冲液(5.2.6)或水将每条引物或者探针分别配制成10μmol/L工作溶
液,备用。-18℃以下分装保存,避免多次冻融。序列见表1。
5.2.8 阳性对照样品:含有牛、绵羊和山羊源成分的样品。
5.2.9 阴性对照样品:不含有牛、绵羊和山羊源成分但含有其他动物成分的样品。
表1 实时荧光PCR检测引物和探针序列
目标物种
引物和
探针名称
序列 基因序列号
片段大
小/bp
18SrRNA
18S-179bp-F
18S-179bp-R
18S-179bp-P
AF176811.1 179
Bov-62bp-F
Bov-62bp-R
Bov-62bp-P
5'-[FAM]-AGGTGCACAGTACGTTC-[NFQ-MGB ]-3'
NC_037352.1 62
绵羊
Ovine-88bp-F
Ovine-88bp-R
Ovine-88bp-P
NC_056069.1 88
山羊
Goat-87bp-F
Goat-87bp-R
Goat-87bp-P
NC_030816.1 87
注:扩增靶标序列见附录 A。
5.3 仪器设备
5.3.1 实时荧光PCR仪。
5.3.2 分析天平:精度0.1mg。
5.3.3 离心机:离心速度不低于14000r/min。
5.3.4 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪。
5.3.5 微量移液器:2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等规格。
5.4 样品
按照GB/T 20195规定制备试样,至少200g,粉碎或碾磨使其全部通过0.25mm孔径的试验筛,充
分混匀,装入密闭容器中,备用。也可采用经过验证等效的其他粉碎或碾磨方法。
同法制备阳性对照样品(5.2.8)和阴性对照样品(5.2.9),备用。
注:粉碎或碾磨一个样品后,清洗粉碎机或碾磨仪的容器和刀具,防止污染。
5.5 试验步骤
5.5.1 DNA提取
平行做两份试验。称取试样100mg~200mg,按照GB/T 19495.3-2004附录C中C.6.2的方法
提取DNA。也可采用经过验证可靠的DNA提取试剂盒进行DNA提取,具体参照说明书使用。提取
空白对照除不加试样外,其他操作同试样一致。必要时,提取阳性对照样品和阴性对照样品的DNA。
提取的DNA如需保存,置于-18℃以下。
5.5.2 DNA溶液浓度测定
用紫外分光光度计(波长:260nm)或微量核酸蛋白测定仪(5.3.4)测定DNA溶液(5.5.1)的浓度。
DNA溶液质量浓度宜控制在5ng/μL~50ng/μL。
5.5.3 对照设置
实时荧光检测过程中应设置阳性对照、阴性对照、扩增空白对照、提取空白对照(5.5.1)。用阳性样
品(5.2.8)的DNA作阳性对照,用阴性样品(5.2.9)的DNA作阴性对照,用等体积的水代替DNA溶液
作为扩增空白对照。
5.5.4 反应体系配制
按表2配制实时荧光PCR检测反应体系。
表2 实时荧光PCR检测反应体系
试剂 试剂浓度 体积/μL
2×实时荧光PCR预混液(5.2.2) 2× 12.5
上游引物 10μmol/L 1
下游引物 10μmol/L 1
探针 10μmol/L 0.5
DNA溶液 5ng/μL~50ng/μL 5
水 - 5
注:不同品牌的实时荧光PCR检测试剂,其反应缓冲液成分可能不同,具体操作参见产品使用说明书。
5.5.5 实时荧光PCR扩增
按表3反应参数在实时荧光PCR仪上进行扩增,以平行测定的Ct值的平均值作为最终结果。
表3 实时荧光PCR反应参数
反应步骤 反应温度 反应时间 循环数
预变性 95℃ 10min 1
热循环
95℃
60℃
15s
1min
注:不同品牌的实时荧光PCR检测试剂,对PCR反应程序的设置(如:变性温度)可能不同,具体操作参见产品
使用说明书。
5.6 质量控制
5.6.1 内参对照基因扩增
真核生物内参对照基因18SrRNA基因检测应符合下列条件,否则重新提取核酸样品:
a) 提取空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值;
b) 扩增空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值;
c) 阴性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤28.0;
d) 阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤28.0;
e) 待测样品:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤33.0。
5.6.2 牛、绵羊和山羊源性特异基因扩增
牛、绵羊和山羊源性特异基因的实时荧光PCR检测应符合以下条件:
a) 提取空白对照:Ct值=40.0或无Ct值;
b) 扩增空白对照:Ct值=40.0或无Ct值;
c) 阴性对照:Ct值=40.0或无Ct值;
d) 阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤35.0。
5.7 结果判定和表述
5.7.1 结果判定
符合5.6时,被测样品的检测结果按以下进行判定:
a) Ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性;
b) Ct值=40.0或无Ct值,则判定为被检样品阴性;
c) 35.0< Ct值< 40.0,则需重新测定。如再次扩增后Ct值仍小于40.0,判定被检样品阳性;如再
次扩增后Ct值=40或无Ct值,判定被检样品阴性。
5.7.2 结果表述
6 聚合酶链式反应法
6.1 原理
根据牛、绵羊和山羊线粒体基因的特异性序列设计引物,采用PCR技术进行扩增。通过电泳分离
PCR产物,与DNA分子量标记比较,并对PCR产物进行测序,与基因库中的物种参照序列进行比
较,实现对牛、绵羊和山羊源性DNA成分的检测。
6.2 试剂与材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。
6.2.1 水:GB/T 6682,一级。
6.2.2 正己烷。
6.2.3 异丙醇。
6.2.4 2×PCR反应预混液:含有TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2 和dNTPs等成分,不应含有
牛血清白蛋白。
6.2.5 体积分数为75%的乙醇。
6.2.6 琼脂糖。
6.2.7 核酸染料Goldview溶液(10000×)。
6.2.8 DNA分子量标记(覆盖100bp~500bp的范围)。
6.2.9 PCR产物回收纯化试剂盒:按使用说明操作。
6.2.10 DNA测序试剂。
6.2.11 体积分数为95%的乙醇。
6.2.12 甲酰胺。
6.2.13 Tris-盐酸溶液(1mol/L):同5.2.4。
6.2.14 EDTA溶液(0.5mol/L):同5.2.5。
6.2.15 溴代十六烷基三甲胺(CTAB)提取缓冲液:在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠,20g溴
代十六烷基三甲胺(CTAB),摇动容器使溶质完全溶解,然后加入50mLTris-盐酸溶液(6.2.13)和
20mLEDTA溶液(6.2.14)用水定容至1L,分装后,在103.4kPa、121℃灭菌20min,备用。
6.2.16 Tris饱和苯酚和三氯甲烷混合液,V(Tris饱和苯酚)+V(三氯甲烷)=1+1。
6.2.17 三氯甲烷和异戊醇混合液,V(三氯甲烷)+V(异戊醇)=24+1。
6.2.18 乙酸钠溶液(3mol/L):在80mL水中,加入40.81g三水合乙酸钠,溶解后用冰乙酸调节pH
值到5.2,用水定容到100mL,分装后,在103.4kPa、121℃灭菌20min,备用。
6.2.19 TE缓冲液:同5.2.6。
6.2.20 引物:用TE缓冲液(6.2.19)或水将每条引物分别配制成10μmol/L工作液,备用。-18℃以
下分装保存,避免多次冻融。序列见表4。
6.2.21 电泳缓冲液:称取54gTris,27.5g硼酸,20mLEDTA溶液(6.2.14),然后用水定容到1L,使
用时10倍稀释。
6.2.22 上样缓冲液:称取溴酚蓝250mg,加水10mL,在室温下过夜溶解;再称取二甲腈蓝250mg,用
10mL水溶解;称取蔗糖50g,用30mL水溶解,合并三种溶液,用水定容至100mL在4℃中保存。
表4 PCR检测引物序列
目标物种 引物名称 序列 基因序列号 片段大小/bp
18SrRNA
18S-179bp-F
18S-179bp-R
AF176811.1 179
Bov-271bp-F
Bov-271bp-R
NC_006853.1 271
绵羊
Ovine-369bp-F
Ovine-369bp-R
NC_001941.1 369
山羊
Goat-293bp-F
Goat-293bp-R
NC_005044.2 293
注:扩增靶标序列见附录B。
6.3 仪器
6.3.1 实验室常用仪器设备。
6.3.2 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪。
6.3.3 PCR扩增仪。
6.3.4 电泳仪。
6.3.5 凝胶成像仪。
6.3.6 DNA序列分析仪。
6.3.7 高压灭菌锅。
6.4 样品
同5.4。
6.5 试验步骤
6.5.1 DNA提取
6.5.1.1 CTAB提取方法
同5.5.1。
6.5.1.2 油脂类饲料中DNA提取方法
平行做两份试验。取油脂饲料适量(液态油取30mL,磷脂类和固态油脂取5g)放入250mL三角
瓶中,加入25mL正己烷(6.2.2),于磁力搅拌器上不断振荡混合2h后,加入25mLCTAB提取缓冲液
(6.2.15),继续于磁力搅拌器上振荡混合2h。将溶液转入100mL离心管中,于8000r/min离心
10min,使有机相和水相分离,取水相,加入与水相溶液等体积的异丙醇(6.2.3)及水相溶液1/10体积的
乙酸钠溶液(6.2.18),轻缓颠倒混匀,室温放置10min后,12000r/min离心10min,弃上清液,待沉淀
干燥后用200μLTE缓冲液(6.2.19)溶解沉淀,加入200μLTris饱和苯酚和三氯甲烷混合液
(6.2.16),轻缓颠倒混匀溶液,12000r/min离心10min,取上清液,加入与上清液等体积三氯甲烷和异
戊醇混合液(6.2.17),轻缓颠倒混匀,12000r/min离心2min至分相。将上清液转移至干净的离心管
中,加入与溶液等体积的异丙醇(6.2.3)及溶液1/10体积的乙酸钠溶液(6.2.18),轻缓颠倒混匀。室温
放置10min后,12000r/min离心10min,弃上清液后,依次加入800μL体积分数为75%的乙醇和
100μL体积分数为75%的乙醇(6.2.5)洗涤沉淀。12000r/min离心5min,弃除乙醇溶液。待沉淀干
燥后,DNA沉淀溶解于100μLTE缓冲液(6.2.19)中,待测或于-18℃以下保存备用。
也可采用经过验证可靠的DNA提取试剂盒,提取空白对照,除不加试样外,其他操作同试样一致。
必要时,提取阳性对照样品和阴性对照样品的DNA。
6.5.2 DNA溶液浓度测定
同5.5.2。
6.5.3 对照设置
同5.5.3。
6.5.4 反应体系配制
按表5配制PCR检测反应体系。
表5 PCR检测反应体系
试剂 试剂浓度 体积/μL
2×PCR反应预混液(6.2.4) 2× 12.5
上游引物 10μmol/L 1
下游引物 10μmol/L 1
DNA溶液 5ng/μL~50ng/μL 5
水 - 5.5
注:不同品牌的PCR检测试剂盒,其反应缓冲液成分可能不同,具体操作参见产品使用说明书。
6.5.5 PCR扩增
按表6的程序在PCR扩增仪(6.3.3)上进行PCR扩增。PCR反应结束后,对反应物进行电泳检测
或在4℃保存备用。
表6 PCR反应程序
反应步骤 反应温度 反应时间 循环数
预变性 94℃ 5min 1
热循环
94℃
56℃
30s
30s
延伸 72℃ 5min 1
注:不同品牌的PCR检测试剂,对PCR反应程序的设置(如:变性温度)可能不同,具体操作参见产品使用说
明书。
6.5.6 PCR扩增产物的电泳检测
将适量的琼脂糖加入电泳缓冲液(6.2.21)中,加热将其溶解,配制成质量分数为1.5%的琼脂糖
(6.2.6)溶液,然后按每100mL琼脂糖溶液中加入5μL核酸染料Goldview溶液(6.2.7)的比例,加入
Goldview溶液,混匀,稍适冷却后,将其倒入电泳板上,室温下凝固成凝胶后,放入电泳缓冲液(6.2.21)
中。取10μL~15μLPCR反应液,加入3μL~5μL上样缓冲液(6.2.22)并混合均匀,在每个泳道中加
入取10μL~15μL的上述混合物,其中一个泳道中加入DNA分子量标记(6.2.8),接通电源,9V/cm
电压,电泳20min~30min。
电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪(6.3.5)上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的
目的条带的大小,将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
对PCR阳性结果的样品,要对PCR扩增产物进行DNA序列测定。
6.5.7 PCR扩增产物直接测序
6.5.7.1 PCR扩增产物的纯化
将60μLPCR反应液与上样缓冲液(6.2.22)混合后,加入预制好的含质量分数为0.8%的琼脂糖凝
胶的泳道中,在其中的一个泳道中加入DNA分子量标记,接通电源进行电泳。在凝胶成像仪下将PCR
特异性增条带切割下来,以下步骤按PCR产物回收纯化试剂盒(6.2.9)说明进行。
6.5.7.2 测序扩增反应
反应体系(20μL):8μLDNA测序试剂(6.2.10),200ng~500ngPCR纯化产物,3.2pmol引物,水
补足至20μL;PCR扩增程序:96℃10s,50℃5s,60℃4min,25个循环,扩增产物4℃保存。
6.5.7.3 测序扩增产物的纯化
扩增管中加入16μL水、64μL体积分数为95%的乙醇(6.2.11),稍混匀,室温放置15min,
12000r/min离心20min,去上清,加入250μL体积分数为75%的乙醇(6.2.5),短暂混匀,12000r/min离
心10min,去上清,室温干燥。
6.5.7.4 测序
纯化产物中加入170μL甲酰胺(6.2.12),95℃,5min,迅速转移至冰上,2min。分装样品测序仪
的加样槽中,自动测序。
6.5.7.5 测序产物拼接
用正向和反向引物分别进行测序扩增反应、纯化和测序,将两次测得序列进行拼接,得到最终PCR
产物测序结果。
6.5.8 PCR扩增产物克隆测序
PCR扩增产物克隆测序按照GB/T 35918-2018附录D执行。
6.6 质量控制
6.6.1 内参对照基因扩增的质量控制
当进行真核生物内参对照基因18SrRNA基因的实时荧光PCR检测时,应符合下列条件,否则要
重新提取样品DNA:
a) 提取空白对照:无扩增条带,或条带比阴性对照、阳性对照和待测样品的扩增条带明显浅;
b) 扩增空白对照:无扩增条带,或条带比阴性对照、阳性对照和待测样品的扩增条带明显浅;
c) 阴性对照:出现179bp片段长度的扩增条带;
d) 阳性对照:出现179bp片段长度的扩增条带;
e) 待测样品:出现179bp片段长度的扩增条带。
6.6.2 目标基因扩增的质量控制
当进行目标基因的实时荧光PCR检测时,应符合下列条件:
a) 提取空白对照:无扩增条带;
b) 扩增空白对照:无扩增条带;
c) 阴性对照:无扩增条带;
d) 阳性对照:检测牛、绵羊、山羊源性成分时,分别出现271bp、369bp、293bp片段长度的扩增
条带。
6.7 结果判定和表述
6.7.1 结果判定
6.7.1.1 待测样品的靶基因扩增PCR产物的电泳结果阴性,判定靶基因检测结果阴性。
6.7.1.2 待测样品的靶基因扩增PCR产物的电泳结果阳性,判定靶基因检测结果阳性。若需要进一步
确证,需进行DNA测序,测序结果与在GenBank中通过BLA......
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