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| 标准编号 | GB/T 21107-2025 (GB/T21107-2025) | | 中文名称 | 饲料中马、驴源性成分的测定 | | 英文名称 | Determination of horse and donkey-derived materials in feeds | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B46 | | 国际标准分类 | 65.120 | | 字数估计 | 13,136 | | 发布日期 | 2025-06-30 | | 实施日期 | 2026-01-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 21107-2007 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 21107-2025: 饲料中马、驴源性成分的测定
ICS 65.120
CCSB46
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 21107-2007
饲料中马、驴源性成分的测定
2025-06-30发布
2026-01-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替GB/T 21107-2007《动物源性饲料中马、驴源性成分定性检测方法 PCR方法》,与
GB/T 21107-2007相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
a) 更改了适用范围和检出限(见第1章,2007年版的第1章);
b) 增加了“缩略语”一章(见第4章);
c) 增加了“实时荧光聚合酶链式反应法”一章(见第5章);
d) 更改了样品(见6.4,2007年版的第7章);
e) 更改了结果判定与表述(见6.6,2007年版的第9章);
f) 更改了实验室污染防治措施(见第7章,2007年版的第10章);
g) 增加了“危害性废弃物处理”一章(见第8章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。
本文件起草单位:上海海关动植物与食品检验检疫技术中心、新希望六和股份有限公司。
本文件主要起草人:蔡一村、潘良文、韩伟、李勇、许镇坚、杨青、张语秋、张晨、邵冰玉、薛俊欣、
林颖峥。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2007年发布的GB/T 21107-2007;
---本次为第一次修订。
饲料中马、驴源性成分的测定
1 范围
本文件描述了饲料中马、驴源性成分的实时荧光聚合酶链式反应和聚合酶链式反应检测方法。
本文件中实时荧光PCR法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、饲料原料、复合预混合饲料和
混合型饲料添加剂中马、驴源性成分的定性检测;PCR法适用于动物源性饲料原料中马、驴源性成分的
检测。
本文件的检出限为0.1%。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
GB T27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
Ct值:循环阈值(cyclethreshold)
5 实时荧光聚合酶链式反应法
5.1 原理
根据马和驴的特异性DNA片段设计引物和探针,采用实时荧光PCR技术进行扩增,根据扩增反
应中产生的荧光信号和Ct值实现对马、驴源性DNA成分的检测。
5.2 试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。
5.2.1 水:GB/T 6682,一级。
5.2.2 2×实时荧光PCR预混液:含有TaqDNA聚合酶、实时荧光PCR缓冲液、MgCl2 和dNTPs等
成分。
5.2.3 氢氧化钠溶液(10mol/L):称取400g氢氧化钠,加水定容至1L。
5.2.4 Tris-盐酸溶液(1mol/L):称取121.1gTris溶解于800mL水中,用盐酸调pH至8.0,加水定容
至1L。在103.4kPa、121℃灭菌20min,室温保存。
5.2.5 EDTA溶液(0.5mol/L):称取186.1gNa2EDTA·2H2O 溶解于800mL水中,磁力搅拌器上
剧烈搅拌,加入氢氧化钠约20g,再滴加氢氧化钠溶液(5.2.3)调pH至8.0,定容至1L,在103.4kPa、
121℃灭菌20min,室温保存。
5.2.6 Tris-EDTA(TE)缓冲液:分别量取10mLTris-盐酸溶液(5.2.4)和2mLEDTA溶液(5.2.5),加
水定容至1L,混匀,在103.4kPa、121℃灭菌20min,备用。
5.2.7 引物和探针:用 TE缓冲液(5.2.6)或水将每条引物或者探针分别配制成10μmol/L工作溶
液,备用。-18℃以下分装保存,避免多次冻融。序列见表1。
5.2.8 阳性对照样品:含有马、驴源成分的样品。
5.2.9 阴性对照样品:不含有马、驴源成分但含有其他动物成分的样品。
表1 引物探针序列
目标物种 引物探针名称 序列 基因序列号
片段大
小/bp
18SrRNA
18S-179bp-F
18S-179bp-R
18S-179bp-P
AF176811.1 179
Horse-125bp-F
Horse-125bp-R
Horse-125bp-P
5'-GCTGTGAAGACCCCGTTGG-3'
NC_009171.3 125
Donkey-95bp-F
Donkey-95bp-R
Donkey-95bp-P
NC_052194.1 95
注:扩增靶标序列见附录 A。
5.3 仪器设备
5.3.1 实时荧光PCR仪。
5.3.2 分析天平:精度0.1mg。
5.3.3 离心机:离心速度不低于14000r/min。
5.3.4 紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪。
5.3.5 微量移液器:2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等规格。
5.4 样品
按照GB/T 20195规定制备试样,至少200g,粉碎或碾磨使其全部通过0.25mm孔径的试验筛,充
分混匀,装入密闭容器中,备用。也可采用经过验证等效的其他粉碎和碾磨方法。
同法制备阳性对照样品(5.2.8)和阴性对照样品(5.2.9)。
注:粉碎或研磨一个样品后,清洗粉碎机或研磨仪的容器和刀具,防止污染。
5.5 试验步骤
5.5.1 DNA提取
平行做两份试验。称取试样100mg~200mg,按照GB/T 19495.3-2004附录C中C.6.2提取
DNA。也可采用经过验证可靠的DNA提取试剂盒进行DNA提取,具体参照说明书使用。提取空白
对照除不加试样外,其他操作同试样一致。必要时,提取阳性对照样品和阴性对照样品的DNA。
注:提取出的DNA如需保存,置于-18℃以下。
5.5.2 DNA溶液浓度测定
用紫外分光光度计(波长:260nm)或微量核酸蛋白测定仪(5.3.4)测定DNA溶液(5.5.1)的质量浓
度。DNA溶液质量浓度宜控制在5ng/μL~50ng/μL。
5.5.3 对照设置
实时荧光检测过程中应设置阳性对照、阴性对照、扩增空白对照、提取空白对照(5.5.1)。用阳性样
品(5.2.8)的DNA作阳性对照,用阴性样品(5.2.9)的DNA作阴性对照,用等体积的水代替DNA溶液
作为扩增空白对照。
5.5.4 反应体系
按表2配制实时荧光PCR检测反应体系。
表2 实时荧光PCR检测反应体系
试剂 试剂浓度 体积/μL
2×实时荧光PCR预混液(5.2.2) 2× 12.5
上游引物 10μmol/L 1
下游引物 10μmol/L 1
探针 10μmol/L 0.5
DNA溶液 5ng/μL~50ng/μL 5
水 - 5
注:不同品牌的实时荧光PCR检测试剂,其反应缓冲液成分可能不同,具体操作参见产品使用说明书。
5.5.5 实时荧光PCR扩增
按表3反应参数在实时荧光PCR仪上进行扩增,以平行测定的Ct值的平均值作为最终结果。
表3 实时荧光PCR反应参数
反应步骤 反应温度 反应时间 循环数
预变性 95℃ 10min 1
热循环
95℃
60℃
15s
1min
注:不同品牌的实时荧光PCR检测试剂,对PCR反应程序的设置(如:变性温度)可能不同,具体操作参见产品
使用说明书。
5.6 质量控制
5.6.1 内参对照基因扩增
真核生物内参对照基因18SrRNA基因检测应符合下列条件,否则重新提取核酸样品:
a) 提取空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值;
b) 扩增空白对照:Ct值≥37.0或无Ct值;
c) 阴性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤28.0;
d) 阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤28.0;
e) 待测样品:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤33.0。
5.6.2 马、驴源性特异基因扩增
马、驴源性特异基因的实时荧光PCR检测应符合以下条件:
a) 提取空白对照:Ct值=40.0或无Ct值;
b) 扩增空白对照:Ct值=40.0或无Ct值;
c) 阴性对照:Ct值=40.0或无Ct值;
d) 阳性对照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤35.0。
5.7 结果判定和表述
5.7.1 结果判定
符合5.6时,被测样品的检测结果按以下进行判定:
a) Ct值≤35.0,则判定为被检样品阳性;
b) Ct值=40.0或无Ct值,则判定为被检样品阴性;
c) 35.0< Ct值< 40.0,则需重新测定。如再次扩增后Ct值仍< 40.0,判定被检样品阳性;如再次
扩增后Ct值=40.0或无Ct值,判定被检样品阴性。
5.7.2 结果表述
6 聚合酶链式反应法
6.1 原理
利用裂解液破碎细胞,三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行
PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。
6.2 试剂或材料
除非另有规定外,仅使用分析纯试剂。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。
6.2.1 水:GB/T 6682,一级。
6.2.2 马、驴源性成分检测用引物(对)序列为:F:5'-TGC CAC AGT TGG ATA CAT CAA C-3'
R:5'-ATT GAG ATT AGG CGA TTG TT-3'。
6.2.3 TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticu,水生栖热菌)。
6.2.4 限制性内切酶:Sau3AI酶,AluI酶。
6.2.6 琼脂糖:电泳纯。
6.2.7 溴化乙锭。
6.2.8 三氯甲烷。
6.2.9 异丙醇。
6.2.10 体积分数为70%乙醇。
6.2.11 分子量标准品(100bp~2000bp)。
6.2.13 TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH
8.0)。
6.2.14 10×PCR缓冲液:100mmol/LKCI,160mmol/L(NH4)2SO4,20mmol/LMgSO4,200mmol/L
6.2.15 电泳缓冲液:Tris54g,硼酸27.5g,0.5mol/LTE缓冲液(pH8.0)20mL,加蒸馏水至
1000mL;使用时10倍稀释。
6.2.16 溴化乙锭贮存液:用水配制成10mg/mL。
6.2.17 加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,质量分数为40%的蔗糖水溶液。
6.2.18 酶切缓冲液:10mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mmol/LMgCl2,50mmol/LNaCl,0.1mg/mLBSA。
6.3 仪器设备
6.3.1 DNA热循环仪。
6.3.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
6.3.3 恒温水浴锅。
6.3.4 离心机:离心力12000g。
6.3.5 微量移液器。
6.3.6 电泳仪。
6.3.7 紫外检测仪。
6.3.8 pH计。
6.3.9 天平:精度0.1mg。
6.4 样品
同5.4。
6.5 试验步骤
6.5.1 总DNA提取
称取100mg试样于1.5mL离心管中,加入600μL~800μL裂解液,涡旋混匀,置于65℃恒温
水浴中保持30min,期间不时振荡混匀;12000g 离心5min,转移上清液于洁净离心管中,加400μL三
氯甲烷+异戊醇(24+1),混匀;12000g 离心5min,取上清液;在上清液中加入等于该上清液体积0.8
倍的异丙醇,沉淀;12000g 离心5min,弃上清液;体积分数为70%的乙醇洗涤一次,晾干;加入
50μLTE,溶解沉淀。
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。
6.5.2 DNA浓度和纯度测定
取5μLDNA溶液加水稀释至1mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和
280nm处的吸光值A260和A280。DNA的质量浓度按公式(1)计算:
c=A×N×50/1000 (1)
式中:
c---DNA质量浓度,单位为微克每微升(μg/μL);
A---260nm处的吸光值;
N---核酸稀释倍数。
当A280/A260比值在1.7~1.9之间时,适宜于PCR扩增。
6.5.3 PCR扩增
25μL的反应体系,在0.2mL的PCR反应管中,加入上下游引物各200nmol/L,10×PCR反应缓
冲液,2mmol/LMgCl2,200nmol/LdNTPs,1.5UTaqDNA聚合酶,1.0μLDNA模板(100ng±
50ngDNA)。
PCR反应条件随仪器不同略有改变,一般的反应程序为:94℃预变性1min~3min,94℃变性
30s~60s,57℃退火30s~60s,72℃延伸30s~60s,30个循环,72℃延伸5min。4℃保存。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含马或驴源性成分的样品作阳性对
照,用已知不含马和驴源性成分但含有其他动物成分的样品作阴性对照,用等体积的水代替模板DNA
作空白对照。
6.5.4 PCR扩增产物电泳检测
取2g琼脂糖,于100mL电泳缓冲液中加热,充分熔化,加入溴化乙锭贮存液至终质量浓度为
0.5μg/mL,制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面刚刚没过凝胶。将5μL~8μLPCR扩增产物
分别和适量加样缓冲液混合,点样。9V/cm恒压电泳,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。紫外检测
仪下观察电泳结果并记录。
6.5.5 限制性内切酶酶切及产物电泳检测
如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性,进行限制性内切酶酶切反应。
反应体系(50μL):Sau3AI酶或AluI酶1μL(10U/μL),酶切缓冲液5μL,PCR扩增产物
20μL,水24μL。充分混匀反应液,37℃水浴1h,65℃水浴5min终止酶切反应。酶切完成后电
泳,方法见6.5.4。
6.6 结果判定与表述
6.6.1 PCR扩增产物电泳检测结果
若PCR扩增产物大小为294bp(序列参考附录B),需要进行酶切;
若无PCR扩增条带为阴性。
6.6.2 限制性内切酶酶切电泳检测......
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