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| 标准编号 | GB/T 21759-2025 (GB/T21759-2025) | | 中文名称 | 化学品 慢性毒性试验方法 | | 英文名称 | Chemicals - Test method of chronic toxicity | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A80 | | 国际标准分类 | 13.300 | | 字数估计 | 14,123 | | 发布日期 | 2025-08-29 | | 实施日期 | 2025-12-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 21759-2008 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 21759-2025: 化学品 慢性毒性试验方法
ICS 13.300
CCSA80
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 21759-2008
化学品 慢性毒性试验方法
2025-08-29发布
2025-12-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替GB/T 21759-2008《化学品 慢性毒性试验方法》,与GB/T 21759-2008相比,除结
构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
a) 增加了“术语和定义”一章(见第3章);
b) 增加了试验方法的一般原则(见4.1)、试验方法的试验原理(见4.2);
c) 更改了试验方法中饲养条件的规定(见4.3.2,2008年版的2.2.4);
d) 更改了试验方法中动物准备的规定(见4.3.3,2008年版的2.2.2);
e) 删除了试验方法的对照组(见2008年版的2.3.2),增加了试验方法中期间解剖动物、卫星组和
哨兵动物的规定(见4.4.2);
f) 删除了试验方法中的染毒柜(见2008年版的2.4.4.1)和物理测量(见2008年版的2.4.4.2)的
规定;
g) 增加了观察、数据和报告中数据的规定(见5.2);
h) 更改了试验报告的一些规则,增加了详细的规定(见5.3,2008年版的3.3)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。
本文件起草单位:深圳海关工业品检测技术中心、宁波检验检疫科学技术研究院(宁波国检贸易便
利化服务中心)、宁波海关技术中心。
本文件主要起草人:吴景武、陈俊彬、刘汉伟、吴树颖、陈有为、刘冬、禹伟腾、孙运、冯均利、张孝先、
陈麒宇、卢斌。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2008年首次发布为GB/T 21759-2008;
---本次为第一次修订。
引 言
GB/T 21759-2008自2008年实施以来,随着科学技术的进步、评估方法的更新以及对动物福利
的日益重视,现需对其进行修订,以确保其符合当前动物福利和管理规定的最新要求。本次修订旨在更
全面地收集动物试验数据,并提供更详细的剂量选择指导。本文件广泛适用于杀虫剂、工业品等多种化
学物质。
慢性毒性试验多数选用啮齿类动物,本文件也主要选用此类动物。如果试验需使用非啮齿类动
物,则本文件所述原则与流程,以及GB/T 21778也在适当调整后予以应用。
慢性毒性试验的染毒途径主要包括经口、经皮和吸入三种。具体选择取决于受试物的物理化学特
性和人群的主要暴露途径。本文件着重关注经口途径,因其为慢性毒性试验中最为常用。尽管在某些
监管制度下,经皮和吸入途径也被视为人体健康风险评估的必要途径,但由于技术难度较高,相关研究
需根据具体情况进行。本文件所述的经口慢性毒性评估方法可为经皮和吸入途径研究提供基础,如处
理周期、临床和病理学参数等。
慢性毒性试验通过研究选定试验动物在长时间重复染毒后可能产生的潜在健康危害,提供受试物
毒性效应信息,识别靶器官以及生物积累的可能性,并估算无可见有害效应剂量水平(NOAEL)以用于
制定人体暴露的安全基准。本文件还强调对试验动物进行细致的临床观察,以获取尽可能多的信息。
化学品 慢性毒性试验方法
1 范围
本文件描述了化学品慢性毒性试验的试验方法,规定了数据和报告内容要求。
本文件适用于化学品慢性毒性试验。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 21753 化学品21天/28天重复剂量经皮毒性试验方法
GB/T 21754 化学品28天/14天重复剂量吸入毒性试验方法
GB/T 21765 化学品 亚慢性吸入毒性试验方法
GB/T 21778 化学品 非啮齿类动物亚慢性(90天)经口毒性试验方法
GB/T 21788 化学品 慢性毒性与致癌性联合试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
有害效应 adverseeffect
生物体、系统或(亚)种群在形态、生理、生长、发育、繁殖或寿命方面的不利变化。
注:这些变化导致其功能能力受损、应对额外压力的能力下降,或对其他影响的敏感性增加。
3.2
剂量 dose
给予实验动物受试物的量。
注:以质量克(g)或毫克(mg)来表示,或以每单位体重实验动物所接受的受试物质量来表示,如 mg/kg。
3.3
观察到有害效应最低剂量水平 lowest-observed-adverse-effect-level;LOAEL
在规定的条件下,受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。
3.4
慢性毒性 chronictoxicity
由于摄入、吸入、皮肤接触或注射某种受试物,在暴露期为12个月或更长时间后产生的有害效应。
3.5
起始点 pointofdeparture;POD
剂量-反应曲线上标志着低剂量外推的起点。
注:通常是观察到的发病率或通过剂量-反应模型估计的发病率的上限。
3.6
受试物进入生物体内的具体方式。
注:例如灌胃口服、通过饮食口服、皮肤接触、吸入、静脉注射等。
3.7
未观察到有害效应剂量水平 no-observed-adverse-effect-level;NOAEL
与对照组相比,在动物身上未造成任何可观察到的且具有统计学显著性的有害效应的受试物最高
剂量水平。
3.8
阈值 threshold
针对特定有害效应的某一剂量或暴露水平。
注:低于它时不会观察到或者预期发生该效应。
4 试验方法
4.1 一般原则
4.1.1 在评估化学品的毒理学特性时,实验室在试验前充分考虑受试物的所有可用信息,以更高效地
评估其慢性毒性潜力,同时最大限度地减少动物使用量。需考虑的受试物信息包括:特性、化学结构、物
理化学性质,毒性作用模式的相关信息,任何体内或体外毒性试验结果,预期用途及人体暴露的可能
性,结构相关物质的(Q)SAR数据及毒理学数据,可用的毒代动力学数据(包括单剂量和重复剂量动力
学)及其他重复暴露试验的数据。只有在通过28天和/或90天重复剂量毒性试验获得初步毒性信息
后,方可进行慢性毒性的测定。慢性毒性测试采用分步测试方法,并将其视为特定化学品潜在健康危害
总体评估的一部分。
4.1.2 根据试验设计和目标,在研究开始前确定最适合结果分析的统计方法。需特别考虑以下情况:
在一组或多组试验提前终止时,是否应对生物存活的数据进行调整和分析。
4.1.3 在重复染毒研究中,若动物表现出渐进式临床症状且病情持续恶化,就是否人道处死该动物做
出明智决定。该决定基于从该动物身上获取的信息价值与其整体生命健康状况的权衡。若决定继续试
验,增加对该动物的观察频率。在不影响试验目的的前提下,可暂时停止染毒以缓解动物疼痛或痛
苦,或者减少染毒的剂量。
4.1.4 慢性毒性与致癌性试验的剂量选择基于试验的主要目标或目的。剂量选择需兼顾以下两方面:
危害筛查的需求;低剂量下毒性效应的表征及其实际意义。当需要同时研究慢性毒性与致癌性时,低剂
量下的毒性效应尤为重要。
4.1.5 在可能的情况下,优先考虑慢性毒性与致癌性的联合试验,而非单独试验。联合试验在时间和
成本上更为高效,且不会影响数据质量。在进行联合试验时,需谨慎考虑剂量选择原则,同时确保符合
相关管理框架的要求。
4.2 试验原理
实验动物每天按设定剂量暴露于受试物,通常持续12个月,但可根据管理要求适当延长或缩短暴
露周期。暴露时间应确保累积的毒性效应显著,同时避免因动物衰老对实验结果产生干扰。若暴露时
间偏离12个月(尤其是缩短暴露周期),需明确说明原因。慢性毒性试验通常采用经口途径给予受试
物,但在适用情况下也可选择吸入或经皮途径。试验设计可包括一次或多次期间剖检(例如在第3个月
和第6个月),此时需增加实验动物的数量。在给予受试物暴露期间,需密切观察动物的毒性效应。对
试验期间死亡或处死的动物,以及试验结束时处死的动物,均需进行解剖。
4.3 实验动物
4.3.1 动物选择
4.3.1.1 慢性毒性评价优先选择啮齿类动物,如管理要求也可选用非啮齿类动物。选择动物种属时应
说明理由。若选用非啮齿类动物,其慢性毒性试验的设计和实施应遵循本文件中的一般原则,并符合
GB/T 21778的相关规定。
4.3.1.2 啮齿类动物优先选择大鼠,也可使用小鼠等其他啮齿类动物。大鼠和小鼠因其寿命较短,在药
理学和毒理学研究中广泛使用,对肿瘤诱导敏感,以及具有充分表征的品系和清晰的生理学及病理学背
景资料,一直是优先选择的模式生物。实验应选用实验室常用品系中健康、成年的年轻动物。慢性毒性
试验所用动物应与预实验中的品系和来源一致。雌性动物应选择未生育且未怀孕的个体。
4.3.2 饲养条件
实验动物可单笼饲养,也可将同剂量组同性别的多只动物同笼饲养;仅在科学合理的情况下才考虑
单笼饲养。尽量减少笼子摆放位置对试验结果的影响。动物房的温度应控制在22℃±3℃,相对湿度
应保持在30%以上,但不超过70%(清洁时段除外),理想范围为50%~60%。采用人工照明,保
持12h光照和12h黑暗交替循环。动物应饲喂常规饲料并自由饮水。饲料应满足实验动物的营养需
求,并尽可能减少可能影响试验结果的污染物(包括但不限于农药残留、持久性有机污染物、植物雌激
素、重金属和霉菌毒素)。应定期分析饲料中的营养成分和污染物含量,至少在研究开始时及饲料批号
发生变化时进行分析。最终报告中需包含饲料和饮用水的分析数据。若受试物通过经口饲喂进行染
毒,需确保含受试物饲料的均一性,并满足动物的营养需求。
4.3.3 动物准备
应使用未经试验的健康动物,并在试验环境下至少适应7天。啮齿类动物应在断乳及适应期后尽
快开始染毒,试验宜在动物8周龄前开始。应记录实验动物种属、品系、来源、性别、体重和周龄信息。
试验开始时,尽量减少同一性别动物的体重差异,偏差不应超过同性别所有动物平均体重的±20%。动
物应随机分配到对照组和试验组。随机分组后,同一性别动物各组的平均体重应无显著差异;若存在显
著差异,应尽可能重新进行随机分组。每只动物应分配唯一的识别号码,并通过文身、植入微芯片或其
他合适的方式进行永久标记。
4.4 试验步骤
4.4.1 动物数量与性别
试验应使用两种性别的动物,并确保动物数量足以满足研究结束时的生物学和统计学评价要求。
对于啮齿类动物,每个剂量水平每种性别不少于20只动物;对于非啮齿类动物,每个剂量水平每种性别
不少于4只动物。若使用小鼠,可能需要增加每个剂量组的动物数量,以满足血液学测定的需求。
4.4.2 期间解剖、卫星组和哨兵动物
为获取毒性效应变化和毒性机制的信息,可在试验中期(例如第6个月)进行期间解剖(至少10只
动物/性别/组)。此外,可设置卫星组以评估受试物引起效应的可逆性;卫星组通常被设置在最高剂量
组和对照组。如有必要,试验期间还可设置哨兵动物组(通常5只动物/性别),用于疾病监测。若设置
期间解剖动物、卫星组或哨兵动物,试验设计需相应增加动物数量,以确保试验结束前计划处死的动物
数量满足要求。这些动物应与主试验动物进行相同的观察,包括体重、食物/水消耗、血液学和临床生化
指标测量,以及病理学检查,期间解剖还可设置特定的检测项目,如神经毒性或免疫毒性等指标。
4.4.3 剂量设计
4.4.3.1 试验应至少设置3个剂量组及一个对照组,限度试验(见4.4.3.7)除外。剂量水平通常基于短
期重复剂量试验或剂量筛选试验的结果,并参考受试物或相关物质的现有毒性及毒代动力学数据。
4.4.3.2 在剂量选择中,试验应确保试验数据(如危害与风险评估、分类与标签、急诊评估等)能够满足
国家监管要求。除非受试物的物理化学性质或生物效应限制,最高剂量水平应选择能识别主要靶器官
和毒性作用,同时避免实验动物产生痛苦、严重毒性反应、发病或死亡的剂量水平。最高剂量组应能产
生明显的毒性效应,例如抑制动物体重增加约10%。然而,根据试验目的,最高剂量组可选择低于产生
毒性作用的剂量。例如,若某一剂量下动物出现有害效应但对寿命或体重影响很小,则可采用该剂量。
最高剂量不应超过1000mg/(kg·d)(即限度剂量)。
4.4.3.3 剂量水平和剂量水平间隔可用于建立剂量-反应关系、NOAEL或其他预期结果(如最低剂量
水平下的基准剂量)。设置低剂量时,考虑以下因素:
---剂量-反应曲线的预期斜率;
---引发代谢或毒性作用模式显著变化的剂量;
---预期的阈值或参考点(POD)。
4.4.3.4 剂量水平间隔取决于受试物的特性,本文件未作具体规定。当设置递减的剂量水平时,2倍~
4倍的剂量水平间隔可提供良好的试验效果。若设置4个测试组,较大的剂量间隔(如6倍~10倍)更
为合适。一般情况下,应避免使用大于10倍的剂量水平间隔;若使用,需说明其合理性。
4.4.3.5 剂量选择时考虑以下因素:
---已知或怀疑为非线性的剂量-反应曲线,或曲线的转折点;
---毒代动力学和剂量范围,包括外部剂量与内部剂量之间的代谢诱导、代谢饱和或非线性关系;
---前体病变、效应标志物或关键生物过程的指标;
---毒性作用模式的关键(或可疑)方面,如细胞毒性起始剂量、激素水平扰动剂量、稳态破坏剂量;
---剂量-反应曲线的关键区间(如基准剂量或阈值附近的曲线);
---预测的人体暴露水平。
4.4.3.6 对照组应为未染毒的组;若染毒时使用赋形剂,则对照组应为溶剂对照组。除了用受试化学品
处理外,对照组的动物应与剂量组相同的处理方式。若使用赋形剂,对照组的赋形剂投加量应与各剂量
组中赋形剂体积最大的组一致。在饮食中投加受试物,若因饮食适口性降低导致饮食摄入量显著减
少,可设置额外的配对喂养对照组。
4.4.3.7 根据预实验结果,若采用本文件所描述的程序能够预测在某一剂量水平[至少为1000mg/
(kg·d)]下进行试验不会产生有害效应,并且基于结构相关物质的数据预测不会产生毒性,则可能无
需采用3个剂量水平进行全面试验。除非人体暴露表明需要更高的剂量水平,否则通常采用的剂量不
应超过1000mg/(kg·d)。
4.4.4 受试物准备与染毒
4.4.4.1 受试物通常通过掺入饲料、饮水或灌胃方式给予。若受试物影响动物饲料或饮水的适口性,应
灌胃给予。选择染毒途径时,需综合考虑试验目的、受试物的物理/化学性质、生物可利用度以及人群暴
露的主要途径和方法,并提供选择该染毒途径和方法的依据。
4.4.4.2 必要时,将受试物溶解或悬浮于适用的赋形剂中。考虑赋形剂及其他添加剂的以下特性:对受
试物的吸收、分布、代谢或保留的影响;是否会通过影响受试物的化学性质改变受试物的毒性特征;以及
对动物的饮食、饮水或营养状况的影响。建议优先选择水溶液/悬浮液,其次为油类(例如玉米油)溶
液/乳液,最后考虑其他赋形剂形成的溶液。对于非水溶剂,需了解其毒性特征。同时,需提供受试物稳
定性、在溶液中或染毒条件(如饮食)下的均一性信息。
4.4.4.3 对于通过饲料掺入或饮水给予的受试物,需确保其用量不会干扰动物的正常摄食、营养平衡及
饮水量。在采用饲料掺入法的慢性毒性研究中,饲料中受试物的掺入比例不得超过质量分数的5%,以
避免营养失衡。当受试物通过饲料掺入给予时,其剂量应以每千克饲料中所含受试物的毫克数
(mg/kg)表示。
4.4.4.4 在经口染毒的情况下,动物需每天(每周7天)接受染毒,染毒周期通常为12个月,但可根据相
关要求延长。若采用其他染毒方案(如每周5天),需提供其合理性的依据。在经皮试验中,依据
GB/T 21753的规定,通常对动物进行每周7天、每天至少6h的受试物处理,染毒周期为12个月。吸
入试验的暴露时间为每周7天、每天6h,但有合理理由的情况下,也可调整为每周5天。暴露持续时间
通常为12个月。对于除大鼠以外的啮齿类动物,若仅通过吸入途径暴露,可调整暴露时间以减少物种
特异性痛苦。若每日暴露时间少于6h,应符合GB/T 21754的规定。
4.4.4.5 采用灌胃法染毒时,应使用胃管或合适的插管,并在每天相似的时间进行染毒。通常每天染毒
一次。若受试物为局部刺激物,可采用分次染毒方式(每天两次,间隔2h~4h)。一次灌胃的最大液体
体积取决于实验动物的体型,体积尽可能小,啮齿类动物通常不超过1mL/100g。受试物剂量以每千
克体重摄入的受试物毫克数(mg/kg)表示。应通过调整液体浓度尽量减少体积偏差,以确保各剂量水
平的灌胃体积一致。对于潜在腐蚀性或刺激性物质,需通过稀释避免对局部产生严重毒性效应,并避免
在可能腐蚀或刺激胃肠道的浓度下进行试验。
4.4.5 试验周期
慢性毒性试验周期通常设计为12个月,但可根据管理要求或特定的机制研究目的,适当缩短(如6
个月或9个月)或延长(如18个月或24个月)受试物的给予时间。若试验周期偏离12个月,需提供其
合理性的依据,尤其是在试验周期较短的情况下。为监测受试物引起的毒理学变化的可逆性,可设置卫
星组。卫星组在暴露终止后需继续饲养不少于4周,且不染毒的时间不超过总试验周期的三分之一。
5 观察、数据和报告
5.1 观察
5.1.1 健康监测与行为观察
5.1.1.1 每日检查所有动物的病变或死亡情况,通常早晚各一次,包括周末和节假日。临床观察宜在每
天的固定时间进行,特别关注灌胃法染毒后可能出现的毒性效应峰值。
5.1.1.2 在首次暴露前、研究第一周结束时以及此后每月对所有动物进行至少一次详尽的临床观察(以
便进行组内比较)。观察方案尽量减少观察者之间的差异,并确保其独立于各试验组。动物应从笼中取
出,在固定区域和固定时间点进行观察。观察结果应详细记录,宜使用测试实验室明确定义的评分系
统。尽量减少观察条件的偏差。记录的现象应包括但不限于皮肤、毛发、眼睛和黏膜的变化,分泌物、排
泄物以及自主活动(如流泪、立毛、瞳孔大小和异常呼吸模式)的出现。同时记录步态、姿势和对处理的
反应的变化,以及阵挛或强直运动、机械运动(如过度梳洗毛发、重复转圈)或怪异行为(如自残、反向行
走)信息。
5.1.1.3 在首次染毒之前,应使用检眼镜或其他合适设备对所有动物进行眼部检查。在研究结束时,至
少对高剂量组和对照组动物进行眼部检查。若高剂量组动物出现眼部变化,则应对所有剂量组动物进
行检查。若结构分析或其他信息表明存在眼部毒性,应增加眼部检查的频率。
5.1.1.4 对于在重复剂量28天和/或90天毒性测试中显示可能引起神经毒性作用且对不同类型刺激
(如听觉、视觉和本体觉刺激)具有感官反应的化学品,可在试验前、试验第3个月~12个月及试验终止
时(若试验持续时间超过12个月)选择进行抓力测试和运动行为测试。
5.1.1.5 对于在重复剂量28天和/或90天毒性测试中显示可能引起免疫毒性效应的化学品,可在试验
结束时选择进一步研究其免疫毒性效应。
5.1.2 体重、饮食、饮水与食物利用率
所有动物应在试验开始时称重,并在前13周至少每周称重一次,之后至少每月称重一次。在前13
周内应至少每周测量一次食物消耗量,并计算食物利用率。若受试物经饮水给予,前13周内应至少每
周测量一次水消耗量,之后至少每4周测量一次。对于可能改变饮水活动的研究,也考虑监测水消
耗量。
5.1.3 血液学与临床生化检查
5.1.3.1 在啮齿类动物试验中,若在第3个月、6个月设置中期检查,12个月及试验终止时(若试验持续
时间超过12个月),应对每组至少10只雄性和10只雌性动物进行血液学检查,并确保使用相同的动
物。对于小鼠,可能需要增设卫星组以完成所有必需的血液学检查。对于非啮齿类动物,血样应从较少
数量的动物中采集(如犬类研究中每组每个性别取4只动物),像啮齿类动物一样在试验过程中及试验
终止时取样。无论是啮齿类还是非啮齿类动物,如90天毒性测试的剂量水平相当,且未观察到与血液
学指标相关的毒性效应,则无需在第3个月进行血液学检查。血样应从指定部位采集,例如通过心脏穿
刺或在麻醉下从眼眶后静脉窦采集。
5.1.3.2 应研究以下参数:白细胞总数及分类计数、红细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、血细胞比
容(细胞压积)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度
(MCHC)、凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间。其他血液学参数,如亨氏小体或其他非典型红细
胞形态或高铁血红蛋白,可根据受试物的毒性酌情测定。总之,应根据受试物观察到的和/或预期的毒
性效应,采用灵活的方法。若受试物对造血系统有影响,可能还需进行网织红细胞计数和骨髓细胞学检
查等非常规检查。
5.1.......
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