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| 标准编号 | GB/T 21773-2025 (GB/T21773-2025) | | 中文名称 | 化学品 体内哺乳动物红细胞微核试验方法 | | 英文名称 | Chemicals - Test method of in vivo mammalian erythrocyte micronucleus | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A80 | | 国际标准分类 | 13.300 | | 字数估计 | 14,198 | | 发布日期 | 2025-08-29 | | 实施日期 | 2025-12-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 21773-2008 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 21773-2025: 化学品 体内哺乳动物红细胞微核试验方法
ICS 13.300
CCSA80
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 21773-2008
化学品 体内哺乳动物红细胞
微核试验方法
2025-08-29发布
2025-12-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
本文件代替GB/T 21773-2008《化学品 体内哺乳动物红细胞微核试验方法》,与GB/T 21773-
2008相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
a) 更改了“试验基本原则”的内容(见第4章,2008年版的第3章);
b) 增加了“实验室能力验证”一章(见第5章);
c) 更改了“动物选择”“饲养条件”“动物准备”和“受试物准备”的内容(见6.1,2008年版的4.1);
d) 更改了“溶剂/赋形剂”和“对照”的内容(见6.2,2008年版的4.2);
e) 更改了“动物的数量和性别”的内容 (见6.3.1,2008年版的4.3.1)、“剂量水平”的内容(见
6.3.2,2008年版的4.3.3)、“限量试验”的内容(见6.3.3,2008年版的4.3.4)、“染毒途径”的内
容(见6.3.4,2008年版的4.3.5)和“染毒程序”的内容(见6.3.5,2008年版的4.3.2);
f) 增加了“观察”(见6.3.6)和“靶组织暴露”的内容(见6.3.7);
g) 更改了“骨髓/血液样本制备”的内容(见6.3.8,2008年版的4.3.6)和“分析(人工分析和自动
分析)”的内容(见6.3.9,2008年版的4.3.7);
h) 更改了“数据处理”的内容(见7.1,2008年版的5.1);
i) 增加了“质量控制”的内容(见7.2);
j) 更改了“结果评价和解释”的内容(见7.3,2008年版的5.2)和“试验报告”的内容(见7.4,2008
年版的5.3)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。
本文件起草单位:中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、中国疾病预防控制中心职业
卫生与中毒控制所、湖南省职业病防治院。
本文件主要起草人:戴宇飞、沈美丽、聂云峰、陈圆圆、李立、邓富昌、顾雯、刘帅。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2008年首次发布为GB/T 21773-2008;
---本次为第一次修订。
引 言
体内哺乳动物红细胞微核试验是一种体内遗传毒性试验方法,通过检测动物(通常是啮齿类)骨髓
或外周血红细胞中微核的形成情况,评估化学品是否引起成红细胞染色体或有丝分裂器的损伤。微核
试验的目的是鉴定可引起细胞遗传损伤的化学品,这种损伤会导致微核的形成,微核中可能含有滞后染
色体断片或整条染色体。哺乳动物体内微核试验对评估化学品的遗传毒性具有特殊意义,虽然可能存
在物种差异,但该试验能反映体内代谢、毒代动力学以及机体DNA修复能力等过程对遗传损伤的影
响。体内微核试验还可用于对体外试验检测到的遗传毒性物质开展进一步的研究。
在骨髓中的成红细胞发育为特定阶段的未成熟红细胞的过程中,其细胞核会被排出,已形成的微核
可能滞留于细胞质中。由于这些细胞无细胞核,因此微核更易观察或检测。在化学品染毒的动物中,若
未成熟红细胞的微核细胞率增加,表明化学品诱发了染色体结构畸变或数目畸变。新形成的含微核的
红细胞经染色处理后,可使用显微镜进行人工观察和计数,也可使用自动化分析方法。使用自动分析系
统能显著提高计数效率,可替代人工计数。进行适当的校准后,自动化分析方法在实验室间和实验室内
的重现性和灵敏度方面要优于人工计数方法。适用于红细胞微核测定的自动分析系统包括但不限于:
流式细胞仪、图像分析平台和激光扫描细胞仪。
在该试验中,染色体断片可通过多种标准与整条染色体区分,例如鉴定动粒或着丝粒DNA的存在
与否,这两者都是完整染色体的特征。若微核中未检测到动粒或着丝粒DNA,说明其中仅包含染色体
断片;若微核中检测到动粒或着丝粒DNA,则表明发生了整条染色体丢失。需要说明的是,上述区分染
色体断片与整条染色体的方法,通常不作为测试的一部分。本试验测试的靶组织为初成年啮齿类动物
的骨髓,因骨髓是红细胞的主要生成场所。若有证据表明,某些哺乳动物物种外周血中未成熟红细胞对
检测化学品导致的染色体结构畸变或数目畸变足够敏感,也可将外周血中未成熟红细胞作为检测对象。
骨髓或外周血中未成熟红细胞的微核细胞率是主要检测终点。若某哺乳动物物种脾脏对含微核细胞的
清除作用较弱,或实验动物连续染毒的时间超过该物种的红细胞寿命(例如小鼠染毒4周或以上),在这
两种情况下,都可选择外周血中成熟红细胞的微核细胞率作为检测终点。
在依据本测试指南获取混合物的毒性评估数据,并将其用于预期监管目的前,需要评估其是否能为
该目的提供符合要求的结果,同时分析可能影响结果适用性的原因。若对混合物的测试有监管要求,则
不必开展上述评估。
化学品 体内哺乳动物红细胞
微核试验方法
1 范围
本文件确立了体内哺乳动物红细胞微核试验方法的试验基本原则,规定了实验室能力验证、试验数
据和报告的内容要求,描述了试验方法。
本文件适用于化学品的体内哺乳动物红细胞微核试验的工作。
本文件不适用于未到达拟检测靶组织的化学品或其代谢物。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB 14925 实验动物 环境及设施
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
着丝粒 centromere
染色体中将两条姐妹染色单体结合起来的区域。
3.2
动粒 kinetochore
由多种蛋白质在细胞分裂时染色体着丝粒部位形成的一种圆盘状结构。
3.3
微核 micronuclei
在有丝分裂(或减数分裂)末期,由滞后染色体断片或整条染色体形成的,与细胞主核分离且独立存
在的小核。
3.4
成熟红细胞 matureerythrocyte
去核后失去残留RNA和/或其他短期标志物的红细胞。
注:能用选择性核糖体染料与未成熟红细胞区分。
3.5
含有残留RNA的处于发育过程中的未成熟红细胞。
注:能用选择性核糖体染料与成熟红细胞区分。
3.6
网织红细胞 reticulocyte
一种经活体染料染色后使残留RNA聚集成特有网状结构的未成熟红细胞。
注:广义的未成熟红细胞包含有核阶段和无核阶段。微核试验主要观察无细胞核的未成熟红细胞,即嗜多染红细
胞或网织红细胞。
4 试验基本原则
采用适当染毒途径对实验动物进行染毒。若使用骨髓样本,在染毒后的适当时间,对动物实施人道
安乐死,随后提取骨髓,并制片和染色。若使用外周血样本,于染毒后的适当时间采集血液,进行制片和
染色。当进行急性染毒时,应选择适宜的骨髓或血液样本采集时间,从而能检测到因染毒诱导产生的含
微核未成熟红细胞。采集外周血样本时,应经过充足的时间,保证微核出现在循环血液中。可通过显微
镜观察、图像分析、流式细胞术或激光扫描细胞仪,对制片中微核存在情况进行检测。
5 实验室能力验证
5.1 能力调查
在使用微核检测方法进行常规测试之前,实验室应展示出具备相应的能力,能重现已发表数据中的
预期结果,包括至少使用两种阳性对照物(含低剂量阳性对照物引起的弱阳性),例如表1推荐的阳性物
质,同时设溶剂/赋形剂对照进行试验。试验所采用的剂量应具备可重复性和显示剂量-反应关系,应能
证实检测方法在目标组织(骨髓或外周血)中的检测灵敏度和动态范围,同时应依据实验室所采用的评
分方法进行分析。此要求不适用于具有检测经验的实验室(即具备历史数据库的实验室)。
5.2 历史对照数据
5.2.1 在能力调查过程中,实验室应建立历史阳性对照范围和分布,以及历史阴性对照范围和分布。
5.2.2 首次获取数据建立历史阴性对照分布时,若存在已发表的对照数据,则平行阴性对照应与已发
表的对照数据保持一致。若更多的试验数据纳入历史对照分布中,平行阴性对照数据应位于该分布的
95%控制限内。实验室的历史阴性对照数据库应具备统计稳健性,以确保能评估其阴性对照数据的分
布特征。实验室建立历史对照数据库的最低要求是至少应进行10次试验并积累对应数据,但宜在可比
试验条件下至少开展20次试验,以进一步提升数据的统计显著性和可靠性。实验室应采用质量控制方
法,例如控制图,来识别数据的变异性,并证明该方法在实验室中处于“受控”状态。建立和使用历史数
据的要求(例如历史数据中数据的纳入和排除标准,以及特定试验的可接受性标准)可参考相关文献。
5.2.3 在能力调查期间,若实验室未能完成充足的试验来建立统计上稳健的阴性对照分布,则可在首
次常规测试时建立,所获得的阴性对照结果应与已发表的阴性对照数据保持一致。
5.2.4 在调整试验方案时,应评估其对试验数据的影响,并确保其与实验室现有历史对照数据库保持
一致。若专家确认该数据库与既往数据分布存在显著差异,应建立新的历史对照数据库。在重建过程
中,若实验室能证明其平行阴性对照值与既往数据库或相应已发表数据具有一致性,则不必建立完整的
阴性对照数据库即可开展实际测试。
5.2.5 阴性对照组数据应包含每只实验动物未成熟红细胞的微核细胞率。平行阴性对照数据应位于
实验室历史阴性对照数据库分布的95%控制限内。若平行阴性对照数据超出上述95%控制限,但数据
不属于极端异常值、可证实检测方法处于“受控”状态以及无技术或人为失误,这些数据就可纳入历史对
照数据库。
注:微核细胞率是含微核的未成熟(或成熟)红细胞数占计数的未成熟(或成熟)红细胞总数的比例,以千分率来表示。
6 试验方法
6.1 准备
6.1.1 动物选择
宜选用健康的初成年动物,可使用小鼠、大鼠或其他合适的哺乳动物。若采用外周血样本,应首先
评估所选物种脾脏对循环血液中含微核细胞的清除作用是否影响检测结果,在小鼠和大鼠的外周血中
已进行过相关评估。若使用小鼠和大鼠以外的物种,应在报告中提供充分的科学依据。对于非啮齿类
动物,宜将微核试验与其他毒性测试相结合。
6.1.2 饲养条件
对于啮齿类动物,实验动物房的温度应为23℃±3℃,相对湿度为30%~70%。采用人工照
明,12h明,12h暗。选用常规饲料,饮水不限。若将受试物掺入饲料中进行染毒,应使受试物与饲料
充分且均匀地混合。若预测动物无攻击性行为,应将同性别及相同处理条件下的啮齿类动物进行群体
饲养。宜采用环境丰富度较高的实底笼具,每笼不应超过5只。若需对动物单独饲养,应说明理由。
6.1.3 动物准备
选用健康的初成年动物(啮齿类动物一般为6周龄~10周龄),随机分为对照组和染毒组。使用人
道且微创的方法对每只动物进行唯一标记(例如带环、标记、微芯片或生物识别,但禁止使用剪耳法或剪
趾法)。试验前动物要在实验动物房环境中至少适应5d。应合理安放笼具,减小位置因素对试验结果
的影响。试验过程中应避免阳性对照组和受试物之间的交叉污染。在试验开始时,实验动物的体重变
异应控制在最小范围,且不超过每种性别平均体重的±20%。
6.1.4 受试物准备
进行染毒前,固态受试物应溶解或悬浮于适宜的溶剂/赋形剂中,或与饲料或饮水充分混合。液态
受试物可直接染毒或适当稀释后染毒。对于吸入暴露试验,应根据受试物的理化性质,采用气体、蒸气
或固/液气溶胶的形式进行暴露染毒。除已明确可以稳定储存并给出储存条件的受试物外,试验中所使
用的受试物应现用现配。
6.2 试验条件
6.2.1 溶剂/赋形剂
溶剂/赋形剂在所使用的剂量水平下不应产生毒性作用,且不应与受试物发生化学反应。常用的相
容性良好的溶剂/赋形剂包括水、生理盐水、甲基纤维素溶液、羧甲基纤维素钠溶液、橄榄油和玉米油。
试验中宜首选水性溶剂/赋形剂。使用不常用的溶剂/赋形剂时,应提供资料证明其适用性;若现有证据
无法表明该溶剂/赋形剂不存在诱发微核及其他有害作用,应开展预试验以确定该溶剂/赋形剂是否可
采用。
6.2.2 对照
6.2.2.1 每次试验应包含平行阳性对照组。若检测实验室已证明具备开展微核试验的能力,并建立了
历史阳性对照数据库,则不必每次试验都设置阳性对照组。若未设置平行阳性对照组,则每次试验都应
包含评分对照。
注:评分对照是在试验分析过程中需纳入的符合分析标准和质量要求的参考样本,具体形式需结合分析方法确定。
该参考样本能通过独立开展的阳性对照试验制备并保存。
6.2.2.2 阳性对照物应可诱发高于本底值的微核细胞率,其升高的程度要达到可检出的水平。当使用
显微镜人工镜检分析时,阳性对照物的剂量选择应使其阳性效应明显,但不使阅片者立即判断出其为阳
性对照片。阳性对照物的染毒途径和染毒程序可与受试物不同,并可仅在单一时间点进行采样。若适
用,可选择与受试物化学类别相关的阳性对照物。常用的阳性对照物见表1。
表1 常用的阳性对照物
化学品 CAS编号
乙基亚硝基脲(Ethylnitrosourea) 759-73-9
丝裂霉素C(MitomycinC) 50-07-7
6.2.2.3 每次试验应设置阴性对照组,且应在每个采样时间点进行采样。阴性对照组除不用受试物染
毒外,其他处理方式应与染毒组相同。若受试物染毒时使用了溶剂/赋形剂,阴性对照组也应使用该溶
剂/赋形剂。若检测实验室的历史阴性对照数据表明,在每个采样时间点动物个体间的变异性以及微核
细胞率都较为稳定,则可对阴性对照组只进行一次采样,且该次采样时间应为试验中首次采样的时间。
6.2.2.4 若使用外周血样本,在短期染毒试验中,当所得数据与实验室历史对照数据库一致时,可用染
毒前的样本来代替平行的阴性对照。染毒前对大鼠进行小体积(例如低于100μL/d)采样,对微核背景
频率的影响很小。
6.3 试验步骤
6.3.1 动物的数量和性别
6.3.1.1 微核反应在雄性和雌性动物之间具有相似性,大多数试验可选择任一性别开展。若有数据显
示雄性和雌性动物之间存在相关差异(例如全身毒性、代谢、生物利用度或骨髓毒性等方面的差异,包括
在剂量预试验中观察到的差异),应同时使用两种性别的动物,并可采用析因设计开展试验。析因设计
及数据分析的内容见附录A。
6.3.1.2 应在试验开始时确定动物数量。若采用单一性别开展试验,每个剂量组至少应有5只可供分
析的动物;若使用两种性别,则每个剂量组的每种性别至少应有5只动物。若某些化学品在人群使用或
接触时具有性别特异性,对这些化学品开展试验时应选择合适性别的动物。
6.3.2 剂量水平
6.3.2.1 若缺乏适用数据,应通过预试验来确定染毒剂量范围。预试验所使用的实验室、动物物种、品
系、性别和染毒方案应与正式试验相同。预试验的目的是确定最大耐受剂量。
注:最大耐受剂量是在试验过程中,动物能耐受且不会因毒性反应而影响试验进行的最高剂量。例如可能导致动
物体重下降或造血系统细胞毒性,但不导致动物死亡或出现必须实施人道安乐死的痛苦症状。
6.3.2.2 最高剂量可定义为导致骨髓毒性的剂量(例如,在骨髓或外周血中,未成熟红细胞占总红细胞
的比例出现50%以上的降低,但该比例不应低于对照值的20%)。若试验采用5d或更短的染毒时
间,染毒的最高剂量可定义为导致CD71+未成熟红细胞占总红细胞的比例显著降低,但不应低于对照
值5%的剂量。
注:当通过流式细胞术检测外周血中CD71+细胞(转铁蛋白受体阳性细胞)时,这类处于网织红细胞分化早期阶段
的细胞群对毒性的反应速度比RNA阳性网织红细胞群更迅速。因此,在急性暴露试验中,与基于RNA含量
识别未成熟红细胞的方法相比,检测CD71+未成熟红细胞更易观察到显著的毒性效应,这也是短期染毒场景
下优先采用该指标定义最高剂量的原因。
6.3.2.3 对于表现出毒代动力学特性饱和的化学品,或者能诱导解毒过程可能导致长期染毒后暴露水
平下降的化学品,应根据具体情况进行个别评估。
6.3.2.4 为获得剂量-反应关系信息,完整的试验应包括一个阴性对照组和至少三个剂量组,相邻剂量
间距可为2倍,但不超过4倍。若预试验或已有数据表明受试物不引起毒性反应,在染毒时间14d及
以上的试验中,最高剂量设定(按体重计)为1000mg/(kg·d);在染毒时间少于14d的试验中,最高剂
量设定(按体重计)为2000mg/(kg·d)。若受试物引起毒性反应,则染毒的最高剂量应为最大耐受剂
量,所使用的剂量宜覆盖从最高剂量至几乎不产生毒性或无毒性的剂量范围。当在所有试验剂量水平
下都观察到靶组织(例如骨髓)毒性时,可在无毒性剂量下进一步研究。若需获得定量剂量-反应关
系,宜增加额外的剂量组。对于某些类型的受试物(例如受特定要求约束的人用药物),应根据具体情况
进行评估。
6.3.3 限量试验
在证实受试物可到达靶组织(例如骨髓)的前提下,若预试验或相关动物品系的现有数据表明,使用
限制剂量(如下所述)染毒未产生可观测到的毒性效应(包括未抑制骨髓增殖或无其他靶组织细胞毒性
的证据),并且根据体外遗传毒性试验结果或结构相似化学品的数据预计受试物不会出现遗传毒性,则
不必使用三个剂量水平进行完整试验;在限制剂量下进行单一剂量水平的试验即可满足要求。若染毒
时间在14d及以上,限制剂量(按体重计)为1000mg/(kg·d);若染毒时间少于14d,限制剂量(按体
重计)为2000mg/(kg·d)。
6.3.4 染毒途径
在设计试验时,应根据预期的人体暴露途径选择适当的染毒方式,例如饮食、饮水、局部皮下注射、
静脉注射、经口(灌胃)、吸入、气管内注入或植入等。所采用的染毒途径应确保靶组织的充分暴露。不
宜使用腹腔注射,因为其不是预期的人体暴露途径,若使用应说明理由。若将受试物掺入饲料或饮水中
进行染毒,尤其是单次染毒时,从动物摄入饲料或饮水到进行样本采集之间应保留足够的时间间隔,从
而能检测到受试物引起的毒性效应。一次灌胃或注射染毒的最大液体体积取决于实验动物的大小,例
如大鼠灌胃染毒每100g体重不宜超过1mL,对于水溶液每100g体重不宜超过2mL。若需使用超过
限量的体积,应说明理由。应通过调整受试物的浓度来减少染毒体积的变化,确保所有剂量水平均按动
物体重比例,以恒定体积进行染毒。但刺激性或腐蚀性受试物除外,其在较高浓度可增强毒性效应。
6.3.5 染毒程序
6.3.5.1 宜进行2次或更多次的染毒,每次染毒间隔24h,尤其是将本试验与其他毒性试验结合时。若
存在合理依据,可进行单次染毒(例如受试物可引起细胞周期阻滞)。若染毒较大体积的溶液,可分次进
行,即在24h内进行2次或多次染毒,染毒间隔为2h~3h。大体积染毒或通过吸入途径染毒时,采样
时间应根据末次染毒时间或暴露结束时间进行安排。
6.3.5.2 试验可在小鼠或大鼠中通过以下三种方式之一进行。
a) 单次染毒。骨髓样本:至少采集两次,首次采样时间不早于染毒后24h,末次不超过染毒后
48h。不同采样之间应保持适当的时间间隔。若采样时间早于染毒后24h,应说明理由。若
受试物具有极长半衰期,可使用其他适宜的采样时间。外周血样本:至少采集两次,首次采样
时间应在染毒后36h,后续采样间隔适当,末次不超过72h。在第一个采样时间点,应对所有
剂量组进行采样和分析;在后续采样时间点,可仅采集最高剂量组。若某一采样时间点检测到
阳性反应,则不必继续采样。若需获取定量剂量-反应关系信息,可进行额外采样。
b) 若染毒2次(例如间隔24h染毒2次),骨髓样本应在末次染毒后18h~24h内采集一次,外
周血样本应在末次染毒后36h~48h内采集一次。
c) 若染毒3次或以上(例如间隔24h染毒3次或以上),应在末次染毒后24h内采集骨髓样
本,或在末次染毒后40h内采集外周血样本。
注:a)和b)中的采样时间是根据微核在靶组织中出现与清除的动力学规律确定的。c)中的染毒方案适合将彗星
试验(例如末次染毒后2h~6h采样)与微核试验相结合,同时也便于将微核试验与重复剂量毒性试验相结
合。当进行3次或更多次染毒时,能在更宽的时间范围内观察到微核。
6.3.5.3 若适用,为了将微核试验和其他毒性试验相结合,可采用其他染毒或采样方案。
6.3.6 观察
应对实验动物进行临床观察,每天至少记录一次临床体征,宜在每天的同一时间进行,并考虑染毒
后预期效应的峰值时段。染毒期间,所有动物每天应至少观察两次是否发病及有无死亡情况。所有动
物应在试验开始时及安乐死前称体重,在重复染毒期间每周至少称重一次。在为期至少一周的试验
中,应每周至少称量一次饲料消耗量。若通过饮水给予受试物,应在每次换水时测量饮水消耗量,每周
至少测量一次。出现非......
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