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| 标准编号 | GB/T 41915-2022 (GB/T41915-2022) | | 中文名称 | 纳米技术 MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性 | | 英文名称 | Nanotechnologies - In vitro MTS assay for measuring the cytotoxic effect of nanoparticles | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | C04 | | 国际标准分类 | 07.120 | | 字数估计 | 34,382 | | 发布日期 | 2022-10-14 | | 实施日期 | 2023-05-01 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 41915-2022
Nanotechnologies -- In vitro MTS assay for measuring the cytotoxic effect of nanoparticles
ICS 07.120
CCSC04
中华人民共和国国家标准
纳米技术 MTS法测定纳米
颗粒的细胞毒性
(ISO 19007:2018,IDT)
2022-10-12发布
2023-05-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
目次
前言 Ⅲ
引言 Ⅳ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 符号和缩略语 2
5 材料 2
5.1 细胞系 2
5.2 检测 3
5.3 对照 3
6 仪器 3
7 纳米颗粒测试样品的制备 3
8 准备 4
8.1 概述 4
8.2 培养基 4
8.3 配制细胞储备液 4
8.4 验证细胞生长状态 4
8.5 验证酶标仪读数一致性 5
8.6 准备对照实验 5
8.6.1 对照实验说明 5
8.6.2 CdSO4 储备液的制备(10mmol/L) 5
8.6.3 纳米颗粒对照悬浮液的制备 5
8.7 精确取液 6
9 表征纳米颗粒对细胞活力的影响 6
9.1 概述 6
9.2 准备细胞培养板 6
9.3 准备纳米颗粒加样板 7
9.4 细胞在细胞培养液中暴露于纳米颗粒 9
9.5 用 MTS试剂处理细胞 9
9.6 测量甲瓒的吸光度 9
10 细胞活力分析 9
11 测试结果解释 10
附录A(规范性) 可供选择的细胞系和检测方法 11
附录B(资料性) 案例:基于A549细胞系的 MTS法(EMPA-NIST草案) 12
附录C(资料性) 案例:基于Raw264.7细胞系的 MTS法(IANH草案) 19
参考文献 24
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件等同采用ISO 19007:2018《纳米技术 MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性》。
本文件做了下列最小限度的编辑性改动:
---修改了原文B.2.2.3和C.2.1.2.3的错误编号(见附录B和附录C);
---将C.2.1.2.1、C.2.1.2.3.12中部分内容调整为“注”;
---参考文献重新排序。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国科学院提出。
本文件由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。
本文件起草单位:国家纳米科学中心、上海理工大学、金石包装(嘉兴)有限公司、中国食品药品检定
研究院。
本文件主要起草人:吴晓春、纪英露、黎燕、赵国途、卿前仲、李海芸、文海若、樊慧真。
引 言
随着新材料、产品和应用的不断开发,纳米技术领域持续快速发展。与此同时,人们对其中一些纳
米材料对人类健康和环境可能造成潜在风险的疑虑也在不断上升。目前国际上正在开展大量的相关研
究,以便更好地了解和量化这些潜在风险。此外,在加工过程中或最终产品中用于纳米颗粒表面包覆的
化学品也可能影响纳米颗粒与细胞之间的相互作用。特别是考虑到纳米颗粒比表面积大的特点,这一
影响可能会更加突出。
细胞是生命的基本单元。监测纳米颗粒暴露后模式细胞的生物响应有望加深我们对纳米颗粒“作
用模式”的理解,以及判断其中哪些因素可能需要进一步研究以便进行后续的风险评估。
2008年,国际上一些研究团队发现,一些已发表的纳米材料毒性研究结果在不同的实验室无法重
复,需要发展准确并可以重复的纳米毒理学测试方法。纳米环境健康与安全(NanoEHS)协调国际联盟
(IANH)应运而生,旨在开发可以准确评估纳米颗粒毒性及其与细胞作用的测试方案,并且这些测试方
案在任何实验室均可重复。IANH通过几种常见的细胞毒性试验,对液体悬浮液中的粒径分布以及纳
米材料与细胞的体外相互作用进行了比对实验(附录 A)。该联盟明确了一些会增加数据波动的因
素,并发展了降低数据波动性的技术。美国国立卫生研究院国家环境卫生科学研究所(NIEHS
NanoGo)资助的研究进一步评价了部分测试方案,尤其是3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-5-(3-羧基甲氧基
苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)的检测方案[4]。第三个团队扩展了IANH的方法并采用统一设
计的多孔板进行实验,提高了分析结果的一致性(附录B)[5]。尤其重要的是上述项目都是采用多个实
验室之间的测试来确定不确定度来源并改进测试方法。
本文件采用 MTS法评估体外细胞的活力[6]。该方法利用孔板中胞浆还原酶催化生成的甲臜(吸
收峰位于490nm)产生显色反应。通常情况下,吸光度的变化与细胞数成正比关系。但检测过程中改
变了还原酶活性或者反应试剂不足量也可能导致显色反应,导致吸光度与细胞活力(如细胞数)不成正
比关系。将 MTS试剂直接添加到细胞培养板中,可以快速评估纳米颗粒的潜在内毒性。由于纳米颗
粒可能会对比色分析产生潜在的干扰,所以在给出最终测试结果之前,进行二者相互作用的对照实验非
常重要。在显微镜下直接观察处理后的细胞是一个验证 MTS检测结果的正交方法。本文件提出的规
范化方案仅用于贴壁细胞,改进后也可用于悬浮细胞。
本方法中纳米颗粒对单独细胞系影响的毒性检测为初级检测。本文件提出的标准方法基于上述
3种MTS分析方案。实验体系的区别见表1。
表1 用于制定标准化 MTS分析方案的研究总结
发起机构 细胞系a 测试用纳米颗粒b 阳性和阴性对照材料 是否离心
IANH Raw264.7 +PS-NP,CeO2 CdSO4,无颗粒暴露 否
NanoGo BEAS-2B、RLE-6TN和 THP-1 ZnO、TiO2、MWCNT 无颗粒暴露 是
EMPA-NISTc A549 +PS-NP CdCl2,无颗粒暴露 否
aATCC细胞库中名称。
b +PS-NP为带正电PS纳米颗粒,CeO2 为二氧化铈,ZnO为氧化锌,TiO2 为二氧化钛,MWCNT为多壁碳纳
米管。
cEMPA为瑞士材料科学与技术国家实验室。
由于这些差异,标准方法中包含了3个实验室研究提出的可选步骤。
除 MTS法[6]外,还有一些方法可用于测定细胞活力,如3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化
四唑(MTT)法[7]、2,3-二-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四氮唑-5-甲酰苯胺(XTT)法[8]、乳酸脱氢酶
(LDH)法[9]、台盼蓝拒染法[10]和中性红测定法[11]。MTS法已进行多组比对实验。MTS法是一种改
进的 MTT法,可提供简单、高通量的细胞活力检测[4,12]。MTS被活细胞中的功能酶还原后,使溶液的
光密度增加。
需要进行对照实验,以确定未经处理细胞的细胞活力基线光密度,并验证细胞对已知无毒纳米颗
粒、有毒化学品和有毒纳米颗粒具有预期响应[13]。此外,确定纳米颗粒是否干扰分析的光学读数,并可
能使纳米颗粒细胞毒性响应的评估无效非常重要[14]。
值得注意的是,这里描述的 MTS法是用于评估纳米材料细胞毒性的诸多商业方法之一。虽然本
文件不涉及评估质膜完整性的LDH法、评估能量代谢的ATP法和DNA合成的BrdU法等,但这些方
法和 MTS法结合在一起,可更为全面地评价纳米颗粒对细胞的综合影响。
纳米技术 MTS法测定纳米
颗粒的细胞毒性
1 范围
本文件描述了用于评价纳米物体及其聚集体和团聚体(NOAA)对细胞活力影响的 MTS方法。此
方法包括操作要求和对照实验,以确定和分析检测结果的不确定性。
本文件适用于96孔板。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
ISO/T S80004-2 纳米科技 术语 第2部分:纳米物体(Nanotechnologies-Vocabulary-
Part2:Nano-objects)
3 术语和定义
ISO/T S80004-2界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
培养器皿 culturevessels
本文件使用的是96孔......
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