搜索结果: GB/T 44829-2024, GB/T44829-2024, GBT 44829-2024, GBT44829-2024
| 标准编号 | GB/T 44829-2024 (GB/T44829-2024) | | 中文名称 | PfAgo核酸内切酶活性检测方法 | | 英文名称 | Assay method of Pf Ago endonuclease activity | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | C27 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 13,113 | | 发布日期 | 2024-10-26 | | 实施日期 | 2024-10-26 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 44829-2024: PfAgo核酸内切酶活性检测方法
ICS 07.080
CCSC27
中华人民共和国国家标准
PfAgo核酸内切酶活性检测方法
2024-10-26发布
2024-10-26实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
目次
前言 Ⅲ
引言 Ⅳ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 原理 1
5 试剂或材料 1
6 试验步骤 2
7 质量控制 7
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国工具酶标准化工作组(SAC/SWG11)提出并归口。
本文件起草单位:交弘生物科技(上海)有限公司、菲鹏生物股份有限公司、南生(厦门)分析检测有
限公司、夏禾(深圳)生物技术有限公司、厦门银祥集团有限公司、深圳市新产业生物医学工程股份有限
公司、武汉新华扬生物股份有限公司、廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司、交弘生物工程(上海)有
限公司、夏禾(杭州)生物技术有限公司、福建南生科技有限公司、上海交通大学、复旦大学、山东大学、苏
州大学、厦门大学、福建农林大学、厦门华厦学院。
本文件主要起草人:冯雁、李忠磊、黄发灿、郑登忠、孟媛、张志刚、杜凯、徐丽、胖铁良、赵毅、陈礼师、
郭延巍、刘倩、潘威、叶星宇、孙鹏、钟江、陈秀兰、方正伟、于海岳、余欣、邓永江、朱力、张永有、刘斌、
赵超、郑恬烨、黄恩铭、皱忠爱、潘排凤、黄海燕、苏静梅。
引 言
PfAgo核酸内切酶能够在5'磷酸化的DNA引导链(大于15nt)的引导下剪切与DNA引导链互
补的靶标DNA,剪切位点一般在DNA引导链5'端开始的第10个和第11个碱基相对应的靶标DNA
碱基之间。PfAgo核酸内切酶的剪切功能不受靶标DNA和剪切位点相邻碱基序列的限制,对靶标
DNA底物的活性较高,对靶标RNA底物也有一定活性。制定PfAgo核酸内切酶活性检测方法的国
家标准,用以推动其产业化,对该类工具酶的生产和使用具有重要意义。
PfAgo核酸内切酶活性检测方法
1 范围
本文件描述了PfAgo核酸内切酶活性的检测方法。
本文件适用于PfAgo核酸内切酶活性的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 191-2008 包装储运图示标志
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
PfAgo核酸内切酶 PfAgoendonuclease
依托DNA引导链(guideDNA,gDNA)序列与靶标DNA(targetDNA,tDNA)序列碱基互补配
对,继而特异识别并剪切靶标DNA的核酸内切酶。
3.2
在25μL反应体积中,95℃条件下,每分钟剪切0.1nmol靶标DNA所需的酶量为一个活性单位(U)。
4 原理
依托DNA引导链序列与靶标DNA序列碱基互补配对,PfAgo核酸内切酶能够在5'磷酸化的
DNA引导链 (大于15nt)的引导下剪切与DNA引导链互补的靶标DNA,剪切位点常发生在DNA引
导链与靶标DNA互补序列的靶标DNA第10位和第11位碱基之间的磷酸二酯键处。
5 试剂或材料
5.1 水
符合GB/T 6682规定的二级水。
5.2 1mol/LTris-HCl(pH8.0)
称取Tris12.114g,加入80mL超纯水中,充分混匀后用6mol/L盐酸调节pH至8.0±0.05,加入
超纯水定容至100.0mL,并用0.22μm微孔滤膜对其过滤,2℃~8℃储存,有效期为24个月。
5.3 5mol/LNaCl
称取NaCl29.220g,加入85.0mL超纯水中,溶解并充分混匀后,使用超纯水定容至100.0mL,并
用0.22μm微孔滤膜对其过滤,2℃~8℃储存,有效期为24个月。
5.4 PfAgo核酸内切酶保存缓冲液
向80.0mL超纯水中加入1.0mL的1mol/LTris-HCl(pH8.0),再加入10.0mL的5mol/L
NaCl,充分混匀后用超纯水定容至100.0mL,并用0.22μm微孔滤膜对其过滤后,以1.0mL/支分装于
1.5mLEP管中,2℃~8℃储存,有效期为24个月。
5.5 10×ReactionBuffer(RB)溶液
量取15.0mL的1mol/LTris-HCl(pH8.0)加入60.0mL超纯水中,再加入20.0mL的5mol/L
NaCl,充分混匀后用超纯水定容至100.0mL,并用0.22μm微孔滤膜对其过滤后,以1.0mL/支分装于
1.5mLEP管中,2℃~8℃储存,有效期为24个月。
5.6 靶标DNA溶液
靶标DNA序列为5'6-FAM-TCAGCGTTCTTCGGAATG-BHQ13'。
将靶标DNA干粉用RNase-free超纯水稀释至10μmol/L,2℃~8℃储存,有效期为24个月。使
用时从2℃~8℃取出平衡至室温,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒。
5.7 DNA引导链溶液
DNA引导链序列为5'P-ATTCCGAAGAACGCTG3'。
将DNA引导链干粉用RNase-free超纯水稀释至100μmol/L,2℃~8℃储存,有效期为1个月。
使用时从2℃~8℃取出平衡至室温,于漩涡混匀器上混匀10s,在微型离心机上离心数秒。
5.8 氯化锰溶液
称取四水合氯化锰0.792g,加入超纯水中,溶解并充分混匀后,使用超纯水定容至100mL,并用
0.22μm微孔滤膜或囊式滤器对其过滤后,以1mL/支分装于1.5mLEP管中,2℃~8℃储存,有效期
为24个月。
5.9 仪器设备
5.9.1 具备15S/次顶部采光配置的实时荧光定量PCR仪。
5.9.2 漩涡混匀器。
5.9.3 微型离心机。
6 试验步骤
6.1 底物-荧光标准曲线的绘制
6.1.1 试剂准备与稀释
将PfAgo核酸内切酶工作溶液(0.500mg/mL)用 PfAgo核酸内切酶保存缓冲液稀释至
0.125mg/mL。将10μmol/L靶标DNA溶液按照表1稀释。该底物稀释后在最终体系中使用5.0μL。
表1 靶标DNA溶液稀释梯度表
靶标DNA量(10-4nmol) 代码 配制方法
100.0 S1
取10.0μL10μmol/L靶标DNA工作液,加入40.0μLRNase-free超
纯水,于漩涡混匀器上混匀10s后,在微型离心机上离心数秒
75.0 S2
取7.5μL10μmol/L靶标DNA溶液,加入42.5μLRNase-free超纯
水,于漩涡混匀器上混匀10s后,在微型离心机上离心数秒
50.0 S3
取14.0μL10μmol/L靶标DNA溶液,加入126.0μLRNase-free超纯
水,于漩涡混匀器上混匀10s后,在微型离心机上离心数秒
37.5 S4
取105.0μLS3,加入35.0μLRNase-free超纯水,于漩涡混匀器上混匀
10s后,在微型离心机上离心数秒
28.1 S5
取105.0μLS4,加入35.0μLRNase-free超纯水,于漩涡混匀器上混匀
10s后,在微型离心机上离心数秒
21.1 S6
取105.0μLS5,加入35.0μLRNase-free超纯水,于漩涡混匀器上混匀
10s后,在微型离心机上离心数秒
15.8 S7
取105.0μLS6,加入35.0μLRNase-free超纯水,于漩涡混匀器上混匀
10s后,在微型离心机上离心数秒
11.9 S8
取105.0μLS7,加入35.0μLRNase-free超纯水,于漩涡混匀器上混匀
10s后,在微型离心机上离心数秒
8.9 S9
取105.0μLS8,加入35.0μLRNase-free超纯水,于漩涡混匀器上混匀
10s后,在微型离心机上离心数秒
0 NC RNase-free超纯水
6.1.2 反应液配制
在微量离心管中按照表2的比例配制反应液(冰上配制),反应液配制完成后,在漩涡混匀器涡旋混
匀10s,微型离心机离心数秒。同时配制背景对照,将DNA引导链替换为等量的 RNase-free超纯
水,其他组成不变。共配制2管,一管为试验组,一管为背景对照组。
表2 反应液配制
反应液组分 规格 1个反应用量/μL
靶标DNA(Vs) - 5.0
DNA引导链 100μmol/L 1.0
氯化锰溶液 40mmol/L 1.0
RNase-free超纯水 - 10.5
PfAgo核酸内切酶 0.125mg/mL 5.0
反应总体积(V1) - 25
配制总体积按公式(1)计算:
V=(3×n+1)×N×(V1-Vs) (1)
式中:
V ---配制总体积,单位为微升(μL);
3 ---重复次数;
n ---靶标DNA梯度的数量,其中包含了非特异性对照组;
1 ---预留损耗;
N ---测试样品数;
V1 ---1个反应的总体积,单位为微升(μL);
Vs ---1个反应中靶标DNA的体积,单位为微升(μL)。
6.1.3 配制后操作
将6.1.2中的反应液在漩涡混匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒,并以(V1-Vs)μL/管分装
于PCR八连管内,盖紧管盖,37℃孵育30min;之后每管加入体积为Vs的梯度浓度靶标DNA,每个梯
度3个重复;盖紧管盖,在微型离心机上离心数秒后备用。背景对照组同上。
6.1.4 运行程序
将装有PfAgo核酸内切酶反应液的PCR八连管置于荧光PCR仪中,荧光采集通道调至FAM,启
动温度程序,在495nm的激发波长和520nm发射波长条件下,95℃反应40min,采集荧光信号。采
样间隔不应大于30s,否则会影响计算精度。
6.1.5 数据处理
将每个靶标DNA梯度下的背景对照组荧光取平均值作为背景荧光,并将试验组荧光值减去相应
背景作为原始荧光数据。
取每条曲线的最大荧光值作为平台期荧光值,然后以初始底物量为横坐标、对应平台期荧光值为纵
坐标绘制散点图,并做过原点的线性拟合,R2 应大于0.95。线性拟合结果作为靶标DNA底物-荧光标
准曲线,用于换算荧光值与靶标DNA底物消耗量。
根据该线性拟合结果,将原始荧光数据转换为靶标DNA底物消耗量,并根据公式(2)计算每条曲
线的最大速度作为初速度(V0):
V0=max
Cp(n+1)-Cp(n)
ΔT
êê
úú (2)
式中:
V0 ---初速度,取每条曲线的最大速度作为初速度,单位为纳摩尔每分(nmol/min);
n ---采样次数,共80次采样,但第80个点无法计算速度,只取到n=79;
Cp(n+1)---第(n+1)个循环时靶标DNA底物消耗量,单位为纳摩尔(nmol);
Cp(n) ---第n个循环时靶标DNA底物消耗量,单位为纳摩尔(nmol);
ΔT --- 采样间隔时间,单位为分(min)。
以靶标DNA底物用量为横坐标、对应曲线的初速度(V0)为纵坐标,绘制散点图,并做米氏曲线拟
合,R2 应大于0.9。
6.2 PfAgo核酸内切酶活性测定
6.2.1 PfAgo核酸内切酶梯度稀释
将PfAgo核酸内切酶工作溶液(0.500mg/mL)用PfAgo保存缓冲液按照表3稀释。
表3 PfAgo核酸内切酶稀释梯度表
PfAgo核酸内切酶量(10-4mg) 代码 配制方法
6.25 E1
取35.0μLPfAgo核酸酶工作溶液(0.500mg/mL),加入105.0μL
PfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混匀10s后,在微型离心机上离
心数秒
4.69 E2
取105.0μLE1,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
3.52 E3
取105.0μLE2,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
2.64 E4
取105.0μLE3,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
1.98 E5
取105.0μLE4,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
1.48 E6
取105.0μLE5,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
1.11 E7
取105.0μLE6,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
0.834 E8
取105.0μLE7,加入35.0μLPfAgo保存缓冲液,于漩涡混匀器上混
匀10s后,在微型离心机上离心数秒
6.2.2 反应液配制
在微量离心管中按照表4的比例配制反应液(冰上配制),反应液配制完成后,在漩涡混匀器涡旋混
匀10s,微型离心机离心数秒。同时配制背景对照,将DNA引导链替换为等量的 RNase-free超纯
水,其他组成不变。共配制2管,一管为试验组,一管为背景对照组。
表4 反应液配制
反应液组分 规格 1个反应用量/μL
靶标DNA 10μmol/L 1.0
DNA引导链 100μmol/L 1.0
氯化锰溶液 40mmol/L 1.0
RNase-free超纯水 - 14.5
PfAgo核酸内切酶(VE) - 5.0
反应总体积(V1) - 25.0
配制总体积按公式(3)计算:
V=(3×n+1)×N×(V1-VE) (3)
式中:
V ---配制总体积,单位为微升(μL);
3 ---重复次数;
n ---PfAgo核酸内切酶梯度的数量;
1 ---预留损耗;
N ---测试样品数;
V1 ---1个反应的总体积,单位为微升(μL);
VE ---1个反应中PfAgo核酸内切酶的体积,单位为微升(μL)。
6.2.3 配制后操作
将6.2.2中的反应液在漩涡混匀器涡旋混匀10s,微型离心机离心数秒,并以(V1-VE)μL/管分装
于PCR八连管内;之后每管加入VE 体积的梯度浓度PfAgo核酸内切酶,每个梯度3个重复;盖紧管
盖,在微型离心机上离心数秒后备用。背景对照组同上。
6.2.4 运行程序
将装有PfAgo核酸内切酶反应液的PCR八连管置于荧光PCR仪中,荧光采集通道调至FAM,启
动温度程序,在495nm的激发波长和520nm发射波长条件下,95℃反应40min,采集荧光信号。采
样间隔不应大于30s,否则会影响计算精度。
6.2.5 数据处理
将每个PfAgo核酸内切酶梯度下的背景对照组荧光取平均值作为背景荧光,并将试验组荧光值
减去相应背景......
|