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| 标准编号 | GB/T 45350-2025 (GB/T45350-2025) | | 中文名称 | 实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法 | | 英文名称 | Laboratory animal - Single nucleotide polymorphisms marker methods for inbred mice and rats | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B44 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 18,192 | | 发布日期 | 2025-02-28 | | 实施日期 | 2025-02-28 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 45350-2025: 实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP标记检测法
ICS 65.020.30
CCSB44
中华人民共和国国家标准
实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP
标记检测法
inbredmiceandrats
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件由全国实验动物标准化技术委员会(SAC/TC281)归口。
本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、上海实验动物研究中心、陕西省中医药研究院、山西医
科大学、广东省实验动物监测所。
本文件主要起草人:魏杰、王洪、岳秉飞、赵莹、李欢、周佳琪、赵丽亚、汤建平、姚养正、宋国华、王静、
范春、陈国强。
引 言
0.1 本文件的发布机构提请注意,声明符合本文件时,可能涉及到6.2近交系大鼠检测(LDR法)与大
鼠SNP位点检测近交系大鼠相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。
该专利持有人已向本文件的发布机构承诺,他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下
就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下
联系方式获得:
专利持有人姓名:赵莹、汤建平、赵丽亚、聂艳艳、姜珊、范春、陈国强、顾晓雪、沈淼、冯艳。
地址:上海市浦东新区金科路3577号。
请注意除上述专利外,本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的
责任。
0.2 遗传背景明确是近交系小鼠、大鼠能够应用于生产、检定、研发等各领域的先决条件。为了提升实
验小鼠、大鼠的遗传质量与标准化水平,我国已发布实施了GB/T 14927.1《实验动物 近交系小鼠、大
鼠生化标记检测法》和GB/T 14927.2《实验动物 近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法》,这两项标准的检
测方法限于蛋白水平,难以实现近交系小鼠、大鼠多品系尤其是亚系的鉴别评价。GB 14923《实验动
物 遗传质量控制》推荐了使用分子生物学方法进行遗传质量监测,但没有相应的技术方法。因此,本
文件通过相关SNP标记的测定进行近交系小鼠、大鼠的遗传质量评价,能够更好地提升近交系小鼠、大
鼠的遗传质量,促进其标准化水平和应用价值的提升。
实验动物 近交系小鼠、大鼠SNP
标记检测法
1 范围
本文件描述了实验动物近交系小鼠、大鼠单核苷酸多态性(SNP)标记检测方法及判断标准。
本文件适用于实验动物近交系小鼠、大鼠遗传组成分析、品系鉴别和质量控制。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB 14923-2022 实验动物 遗传质量控制
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
在基因组水平上由单个核苷酸在位置上发生转换、颠换、插入或缺失等引起的DNA序列多态性。
3.2
利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别的方法。
注:高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配,则连
接反应就不能进行。
3.3
纯合性 homozygosity
同源染色体的相对位置上具有相同等位基因的状态。
注:近交系动物通过连续的近亲交配绝大部分的位点都具有纯合性。一个品系内任何个体间进行交配产生的后代
也具有纯合性。
4 试剂与仪器
4.1 试剂
DNA提取试剂盒、PCR反应及产物纯化试剂盒、测序反应试剂盒、琼脂糖。
4.2 实验设备和器材
4.2.1 仪器设备:电泳仪、离心机、PCR仪、紫外凝胶成像系统、遗传分析仪、水浴锅、微波炉、混匀振
荡器。
4.2.2 器材:剪刀、镊子、采血管、移液器、离心管、PCR管、琼脂糖制胶板。
5 方法原理
小鼠和大鼠基因组内均存在数量极为丰富的SNP位点。通过筛选品系特异性的SNP标记位
点,并在该位点上下游设计引物,通过PCR扩增、连接酶反应、测序、毛细管电泳等分子生物学方法分
析,得到各近交系的遗传概貌,定期进行遗传质量监测。
6 位点选择
6.1 近交系小鼠检测(直接测序法)
常规近交系小鼠选取表1中前27个SNP标记进行PCR扩增,使用直接测序法进行检测。
除表1前27个标记外,C57BL/6亚系需要加测表1中28号~32号SNP标记,BALB/c亚系需要
加测表1中33号~35号SNP标记。
各实验室可根据自身条件设计或选择引物。表2中引物和退火温度可供参考。
表1 近交系小鼠35个SNP位点
序号 SNP位点 序号 SNP位点 序号 SNP位点 序号 SNP位点
1 rs3022796 10 rs3023177 19 rs3023382 28 rs3709624
2 rs3022825 11 rs3023203 20 rs3091048 29 rs3659787
3 rs3022883 12 rs3023226 21 rs3091174 30 rs3722313
4 rs3022953 13 rs3089984 22 rs3023436 31 rs3702158
5 rs3022977 14 rs3089109 23 rs3023442 32 rs3724876
6 rs3023034 15 rs3088673 24 rs3023450 33 rs3712692
7 rs3023039 16 rs3023251 25 rs3089349 34 rs3706082
8 rs3023064 17 rs3023342 26 rs3023481 35 rs3656801
9 rs3023162 18 rs3023381 27 rs3089604 - -
表2 近交系小鼠35个SNP引物及退火温度
序号 引物 引物序列
产物
bp
退火温度
染色体位置
rs3022796-F GTATGGTGGGGAGAGCACAC
rs3022825-F GGCACTGCAGTATTAGCCGA
rs3022883-F AGTTTGGGGGAGGAACCCTG
表2 近交系小鼠35个SNP引物及退火温度 (续)
序号 引物 引物序列
产物
bp
退火温度
染色体位置
198 59 3
385 59 4
249 60 5
rs3023039-F CAGCCATACCACTCTGCTCC
rs3023064-F GCCCAGCCAGTGGGTC
153 58 6
262 60 7
200 59 8
rs3023203-F GGTCTCTTGGCATCTGGCAT
rs3023226-F GTGACAACCCTCCTGGTGTA
199 60 10
191 59 10
rs3088673-R TGGTGATAGTGATGGGCTCT
rs3023342-F TGACTGGACCGTAACGAGAG
rs3023381-F GAGGTAGAGATGCAGCAGGG
rs3023382-F AGGAGCCGCTGGTTCTGATA
表2 近交系小鼠35个SNP引物及退火温度 (续)
序号 引物 引物序列
产物
bp
退火温度
染色体位置
185 60 14
198 59 15
rs3023436-R AGATGCACGTTCACACTGAT
297 60 17
rs3023450-F ATGGATCAGGGAAGAGCACC
299 61 18
rs3023481-R CAGCACTTTCCACAGTTGGG
673 61 8
277 59 11
rs3722313-F GTGTCTCTCACCAGGACAGC
236 59 15
rs3724876-R CAAGTTCCCTTTTGGCTGGC
241 60 4
rs3656801-F ACCCACGAGAACAATGAGGC
6.2 近交系大鼠检测(LDR法)
21个SNP位点共分为2组进行PCR-LDR反应,表3、表4分别为21个SNP位点的引物和探
针,覆盖大鼠的20条常染色体和X染色体。每个位点的通用modify探针需3'荧光标记,5'磷酸化。
表3 21个近交系大鼠SNP位点引物染色体分布
组别 SNP位点 引物序列 染色体
MgCl2
mmol/L
退火温度
rs65970293
ATAGGGCCAAGGTCCCATTC
CCACGGTCCCTATGTGAACT
rs107261116
CGGGGATCAAAGAGACAAAA
CATGGCACACCTTTCTTTCA
rs64682441
ATCCCTCTCTTTGCCAGGAT
CTGCTCTTGGATGAAAACCA
AAAGCACAAAAATGCCATCC
ATTAGCCACGGATGAAGTGG
AAACCTGGCTTTAGCAAGCA
表3 21个近交系大鼠SNP位点引物染色体分布 (续)
组别 SNP位点 引物序列 染色体
MgCl2
mmol/L
退火温度
rs106888236
rs63814610
CGTGTCATTCCTGACTGTGG
GGCCACCAAAGATACACAGG
rs65108991
表4 21个近交系大鼠SNP位点探针的序列
位点名称 探针序列
表4 21个近交系大鼠SNP位点探针的序列 (续)
位点名称 探针序列
表4 21个近交系大鼠SNP位点探针的序列 (续)
位点名称 探针序列
6.3 近交系大鼠检测(直接测序法)
常规近交系大鼠选取表5中前31个SNP标记进行PCR扩增,使用直接测序法进行检测。
研究大鼠免疫遗传标记,可加测表5中32号~38号SNP标记。
各实验室可根据自身条件设计或选择引物。表6中引物和退火温度可供参考。
表5 近交系大鼠38个SNP标记检测位点
序号 SNP位点 序号 SNP位点 序号 SNP位点
1 rs64750237 14 rs106610489 27 rs13453252
2 rs106888236 15 rs13453115 28 rs64102787
3 rs106458396 16 rs105753760 29 rs106647405
4 rs107038347 17 rs8173311 30 rs65545562
5 rs106672258 18 rs66190198 31 rs105694545
6 rs105466309 19 rs106506161 32 rs13458024
7 rs65921305 20 rs106996961 33 rs8166089
8 rs106795993 21 rs65729677 34 rs8158177
9 rs106891788 22 rs65970293 35 rs13457316
10 rs65801920 23 rs8170947 36 rs13448591
11 rs8164880 24 rs107097763 37 rs13456231
12 rs105008665 25 rs8173257 38 rs8149053
13 rs8152541 26 rs105187832 - -
表6 近交系大鼠38个SNP引物及退火温度
序号 引物 引物序列
产物
bp
退火温度
染色体位置
1 rs64750237
2 rs106888236
203 58 16
3 rs106458396
4 rs107038347
5 rs106672258
378 58 12
6 rs105466309
468 58 5
7 rs65921305
555 58 13
8 rs106795993
702 58 11
9 rs106891788
156 58 1
10 rs65801920
196 58 9
11 rs8164880
261 58 14
12 rs105008665
355 58 2
13 rs8152541
430 58 18
14 rs106610489
499 58 2
15 rs13453115
16 rs105753760
788 58 14
表6 近交系大鼠38个SNP引物及退火温度 (续)
序号 引物 引物序列
产物
bp
退火温度
染色体位置
17 rs8173311
359 58 19
18 rs66190198
214 58 11
19 rs106506161
268 58 10
20 rs106996961
366 58 2
21 rs65729677
480 58 5
22 rs65970293
539 58 1
23 rs8170947
679 58 2
24 rs107097763
191 58 2
25 rs8173257
331 58 17
26 rs105187832
300 58 7
27 rs13453252
349 58 20
28 rs64102787
29 rs106647405
469 58 4
30 rs65545562
31 rs105694545
32 rs13458024
172 58 20
表6 近交系大鼠38个SNP引物及退火温度 (续)
序号 引物 引物序列
产物
bp
退火温度
染色体位置
33 rs8166089
34 rs8158177
35 rs13457316
36 rs13448591
37 rs13456231
576 58 20
38 rs8149053
7 操作步骤
7.1 采样
近交系采样原则按照GB 14923-2022中5.2.1.1,具体操作如下:
a) 观察动物外观,核对编号;
b) 经眼底静脉采血200μL,或取0.5cm尾尖,-20℃低温保存;
c) 提取基因组 DNA:用苯酚氯仿法或试剂盒提取基因组 DNA。紫外分光光度计测浓度在
OD260/280在1.8~2.0之间,质量浓度调整为30ng/μL~40ng/μL。
7.2 小鼠SNP直接PCR测序分型法
7.2.1 PCR扩增体系
PCR总反应体积为30μL,其中10× PCRbuffer(Mg2+)为3μL,上下游引物(10pmol/μL)各
1μL,dNTP2.5mmol/L为3μL,Taq酶5U/μL为0.2μL,30ng/μL基因组DNA为1μL,纯水补齐
体积。本体系推荐使用普通Taq酶。
7.2.2 PCR反应程序
95℃预变性,3min;94℃变性,1min;退火温度(各位点退火温度见表2),1min;72℃延伸,
1min;35个循环;72℃继续延伸8min;扩增产物4℃保存。
7.2.3 电泳检测与产物纯化
制备1×TAE制备1.5%琼脂糖凝胶,取PCR扩增结果5μL,用移液器在凝胶上点样。凝胶成像
系统记录检测结果。
使用PCR产物纯化回收试剂盒对目的产物进行纯化回收。
7.2.4 产物测序
7.2.4.1 测序扩增体系及反应程序
纯化PCR产物可送交有资质的测序公司进行测序分析,或参照如下步骤进行测序。
总反应体积为5μL,其中5×buffer为0.8μL,Bigdye为0.4μL,单向引物(3.2pmol/μL)为
1μL,纯化PCR产物(质量浓度不低于20ng/μL)为1μL,纯水补齐体积。测序扩增反应置于冰上
操作。
测序扩增程序:96℃预变性,2min;96℃变性,10s;55℃,5s;60℃,90s;25个循环;4℃保存。
使用配套HIDI变性纯化试剂盒将测序扩增产物进行纯化及变性解链处理。
7.2.4.2 上机测序与结果输出
按照遗传分析仪操作手册建立并启动测序程序,获得峰图后对其进行命名和分析,判断突变的有无
及类别,使用软件分析,得到检测个体的SNP位点碱基类型。
7.3 大鼠SNP采用PCR-LDR分型法
7.3.1 PCR扩增体系
PCR总反应体积为20μL,其中10× PCRbuffer为2μL,GC 溶液为2μL,上下游引物
(0.5pmol/μL)各2μL,dNTP(各2.5mmol/L)为1.6μL,镁离子(25mmol/L)为2.4μL,Taq 酶
(5U/μL)为0.1μL,50ng~100ng基因组DNA为2μL,纯水补足20μL。
7.3.2 PCR反应程序
反应程序:95℃预变性15min;94℃变性30s,退火温度(各位点退火温度见表3)90s,72℃延伸
1min,35个循环;72℃继续延伸10min;4℃ 保存。
7.3.3 LDR反应体系
LDR总反应体积为20μL,其中10×buffer为2μL,位点特异探针(0.5pmol/μL)各2μL,模板
(PCR产物)为8μL,TaqDNA链接酶(40U/μL)为0.2μL,加水补足20μL。
7.3.4 LDR反应程序
反应程序:95℃预变性2min;94℃变性30s,50℃连接2min,30个循环;4℃保存。
7.3.5 产物检测
7.3.5.1 产物变性
总体积为10μL,PCR-LDR产物为1μL,去离子甲酰胺HIDI为8μL,内参ROX为1μL。
7.3.5.2 变性程序
95℃变性5min,迅速放在冰水浴中。5min后,可上机检测。
7.3.5.3 产物检测
将变性后的产物放入一代自动测序仪中进行分析,按照一代测序仪操作手册建立并启动检测程
序,获得峰图后对其进行命名和分析,判断突变的有无及类别,使用仪器配套的分型软件,得到检测个体
的SNP位点碱基类型。
7.4 大鼠SNP直接PCR测序分型法
7.4.1 PCR扩增体系
PCR总反应体积为40μL,其中10×PCRbuffer(Mg2+)为4μL,上下游引物(10pmol/μL)各
1μL,dNTP2.5mmol/L为3.2μL,Taq酶5U/μL为0.2μL,30ng/μL基因组DNA为1μL,纯水补
齐体积。本体系推荐使用普通Taq酶。
7.4.2 PCR反应程序
95℃预变性,5min;96℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃继续延伸
8min;扩增产物4℃保存。
7.4.3 电泳检测与产物纯化
制备1×TAE制备1.5%琼脂糖凝胶,取PCR扩增结果5μL,用移液器在凝胶上点样。凝胶成像
系统记录检测结果。
使......
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