搜索结果: GB 4789.5-2012, GB4789.5-2012
| 标准编号 | GB 4789.5-2012 (GB4789.5-2012) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验 | | 英文名称 | National food safety standard -- Microbiological examination of food hygiene -- Examination of shigella | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 07.100.30 | | 字数估计 | 17,179 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 4789.5-2003 | | 标准依据 | 卫生部公告2012年第9号 | | 发布机构 | 中华人民共和国卫生部 | | 范围 | 本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验方法。本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。 | GB 4789.5-2012: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验
GB 4789.5-2012 英文名称: National food safety standard -- Microbiological examination of food hygiene -- Examination of shigella
中华人民共和国国家标准
1 范围
本标准规定了食品中志贺氏菌(Shigella)的检验方法。
本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取检样 25 g（mL），加入装有灭菌 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均
质器以 8 000 r/min～10 000 r/min 均质；或加入装有 225 mL 志贺氏菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质
器连续均质 1 min～2 min，液体样品振荡混匀即可。于 41.5℃±１℃，厌氧培养 16 h～20 h。
5.2 分离
取增菌后的志贺氏增菌液分别划线接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板
上，于 36 ℃±1℃培养 20 h～24 h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大
于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至 48 h再进行观察。志贺氏菌在
不同选择性琼脂平板上的菌落特征见表 1。
5.3 初步生化试验
5.3.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种TSI、半固体和营养琼脂斜面各一
管，置36℃±1 ℃培养20 h～24 h，分别观察结果。
5.3.2 凡是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖，不发酵乳糖，蔗糖）、不产气（福氏志贺氏
菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢、半固体管中无动力的菌株，挑取其5.3.1中已培养的营养琼脂斜面
上生长的菌苔，进行生化试验和血清学分型。
5.4 生化试验及附加生化试验
5.4.1 生化试验
用 5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧
酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷的分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌 13 型的鸟氨酸阳
性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌 1型，鲍氏志贺氏菌 13 型的β-半乳糖苷酶为阳性以外，其余生化试验志贺氏
菌属的培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌 6型的生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似，
必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验，也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶
阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定
为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表 2。
5.4.2 附加生化实验
由于某些不活泼的大肠埃希氏菌（anaerogenic E.coli）、A-D（Alkalescens-D isparbiotypes 碱性-异型）
菌的部分生化特征与志贺氏菌相似，并能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集；因此前面生化实验符合志贺
氏菌属生化特性的培养物还需另加葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验(36℃培养 24 h～48 h)。志
贺氏菌属和不活泼大肠埃希氏菌、A-D菌的生化特性区别见表 3。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培
养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1抗原的准备
志贺氏菌属没有动力，所以没有鞭毛抗原。志贺氏菌属主要有菌体（O）抗原。菌体 O抗原又可分为
型和群的特异性抗原。
一般采用 1.2%～1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
注 1：一些志贺氏菌如果因为 K抗原的存在而不出现凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL生理盐水做成浓菌液，100 ℃煮
沸 15 min～60 min去除 K抗原后再检查。
注 2：D群志贺氏菌既可能是光滑型菌株也可能是粗糙型菌株，与其他志贺氏菌群抗原不存在交叉反应。与肠杆菌科不
同，宋内氏志贺氏菌粗糙型菌株不一定会自凝。宋内氏志贺氏菌没有 K抗原。
5.5.2 凝集反应
在玻片上划出 2个约 1cm×2cm的区域，挑取一环待测菌，各放 1/2环于玻片上的每一区域上部，在其
中一个区域下部加 1滴抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分
别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对着黑色背景进行观察，如果抗血清
中出现凝结成块的颗粒，而且生理盐水中没有发生自凝现象，那么凝集反应为阳性。如果生理盐水中出现
凝集，视作为自凝。这时，应挑取同一培养基上的其他菌落继续进行试验。
如果待测菌的生化特征符合志贺氏菌属生化特征，而其血清学试验为阴性的话，则按 5.5.1注 1 进行试验。
5.5.3 血清学分型（选做项目）
先用四种志贺氏菌多价血清检查，如果呈现凝集，则再用相应各群多价血清分别试验。先用 B群福氏
志贺氏菌多价血清进行实验，如呈现凝集，再用其群和型因子血清分别检查。如果 B 群多价血清不凝集，
则用 D群宋内氏志贺氏菌血清进行实验，如呈现凝集，则用其Ⅰ相和Ⅱ相血清检查；如果 B、D 群多价血
清都不凝集，则用 A群痢疾志贺氏菌多价血清及 1～12 各型因子血清检查，如果上述三种多价血清都不凝
集，可用 C群鲍氏志贺氏菌多价检查，并进一步用 1～18各型因子血清检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的
型抗原和群抗原鉴别见表 4。
5.6 结果报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告 25 g（mL）样品中检出或未检出志贺氏菌。
附录A
A.3.2 制法
除酚红和琼脂外，将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中，煮沸溶解，校正 pH至 7.4±0.2。另将琼脂加
入 600 mL 蒸馏水中，煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后，再加入指示剂，待冷至 50℃~55℃倾注平皿。
注：本培养基不需要高压灭菌，在制备过程中不宜过分加热，避免降低其选择性，贮于室温暗处。本培养基宜于当天
制备，第二天使用。使用前必须去除平板表面上的水珠，在 37 ℃～55℃温度下，琼脂面向下、平板盖亦向下烘干。另外
如配制好的培养基不立即使用，在 2 ℃~8 ℃条件下可储存二周。。
A.7.3 试验方法
用接种针轻轻触及培养物的表面，在盐水管内做成极稀的悬液，肉眼观察不到混浊，以每一接种环
内含菌数在 20~100之间为宜。将接种环灭菌后挑取菌液接种，同时再以同法接种普通斜面一支作为对
照。于 36 ℃±1 ℃培养 24 h。阳性者葡萄糖铵斜面上有正常大小的菌落生长；阴性者不生长，但在对照
培养基上生长良好。如在葡萄糖铵斜面生长极微小的菌落可视为阴性结果。
注：容器使用前应用清洁液浸泡。再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做成棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时
不注意，有杂质污染时，易造成假阳性的结果。
A.8.2 制法
除酚红和尿素外的其他成分加热溶解，冷却至25 ℃左右校正pH至7.2±0.2，加入酚红指示剂，混匀，
于121 ℃灭菌15 min。冷至约55 ℃，加入用0.22 µm过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100 mL，混匀，以
无菌操作分装灭菌试管，每管约3 mL~4 mL，制成斜面后放冰箱备用。
A.8.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种，在 36 ℃±1 ℃培养 24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。
A.9.2.3 试验方法
挑取琼脂斜面培养物接种于平板，划线和点种均可，于36 ℃±1 ℃培养18 h~24 h观察结果。如果β-D-
半乳糖苷酶产生，则平板上培养物颜色变蓝色，如无此酶则培养物为无色或不透明色，培养48 h~72 h后有部分转为淡粉红色。
A.10 氨基酸脱羧酶试验培养基
A.10.2 制法
除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶 100 mL，分别加入赖氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按 0.5%
加入，DL-氨基酸按 1%加入，再校正 pH至 6.8±0.2。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，
每管 0.5 mL，上面滴加一层石蜡油，115 ℃高压灭菌 10 min。
A.10.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由
......
|