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| 标准编号 | LY/T 3191-2020 (LY/T3191-2020) | | 中文名称 | 林木DNA条形码构建技术规程 | | 英文名称 | Technical regulations of DNA barcodes in woody species | | 行业 | 林业行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B60 | | 国际标准分类 | 65.020 | | 字数估计 | 12,11 | | 发布日期 | 2020-03-30 | | 实施日期 | 2020-10-01 | | 标准依据 | 国家林业和草原局公告2020年第6号 | | 发布机构 | 国家林业和草原局 | LY/T 3191-2020: 林木DNA条形码构建技术规程
LY/T 3191-2020 英文名称: Technical regulations of DNA barcodes in woody species
中 华 人 民 共 和 国 林 业 行 业 标 准
林木 DNA条形码构建技术规程
国家林业和草原局 发 布
前言
本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本标准由国家林业和草原局提出。
本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）会归口。
本标准起草单位：中国林业科学研究院热带林业研究所，湖南省林业科学院，中国科学院华南植物
园，中国科学院植物研究所，江西农业大学林学院。
本标准主要起草人：裴男才、梁军生、陈步峰、葛学军、米湘成、刘娟。
林木 DNA 条形码构建技术规程
1 范围
本标准规定了林木 DNA 条形码构建中样本采集策略、核心 DNA 条形码片段选取标准、DNA 提取
技术和保存、序列测定和编辑方法、系统发育关系构建等技术要求。
本标准适用于林木DNA条形码的构建。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SN/T 4625-2016 DNA条形码筛选与质量要求
SN/T 4626-2016 DNA条形码物种鉴定操作规程
SN/T 4714-2016 DNA条形码数据库技术规范
4 样本采集策略
4.1 采集部位。干净的成熟叶片最佳，特殊情况下可采集枝条、树根和树皮韧皮部等材料；避免采
集被虫咬、有病菌的叶片。
4.2 样品重量。阔叶树叶片5-10片，细羽状复叶或针叶树叶片5-10克；足够用于DNA提取。
4.3 样品数量。常见种3-5个来源于不同居群的个体，稀有种尽量多采集；避免样品中出现错误鉴
定的物种。
4.4 样品编号。结合样地中物种号和树牌号进行编号；多个个体时，需作区分；如樟树-1(+树牌号)，
樟树-2(+树牌号)。详细记录采集时间。
4.5 样品保存。直接将材料置于封口袋，在封口袋中倒入干净的硅胶；或将材料放入空茶包中，可
不与硅胶直接接触，确保材料不受污染。若材料含水量较高，注意及时换新的硅胶，保证材料品质；正
常情况下硅胶颜色深蓝，若吸水较多，硅胶颜色将变为浅紫红，此时需换新的硅胶。条件允许的情况下，
对一些叶片材料不容易提取DNA的样品可以采用冷藏保存。
4.6 凭证标本。植株整体/局部、大生境/微生境的照片和信息，记录伴生种及经纬度等。凭证标本
要求带花或果实的枝条；无花或果实时，则用带叶的枝条。记录树木的标牌号以及与自封口袋上的样品
编号。每个样点和每个物种采集3份以上凭证标本；采集后当天压制，最后统一交付标本馆保存。
5 核心DNA条形码片段选取标准
5.1 进化速率。进化速率较慢的片段可以锚定目标物种到科/属的较高分类等级，化速率较快的片段
则可将近缘类群进行识别和分辨。
5.2 分辨能力。种间有明显的遗传变异，而种内变异足够小；片段所含的变异位点多则分辨力高；
进化速率较快的片段比进化速率较慢的片段有更高分辨力；组合片段比单个片段提供更多的变异位点。
5.3 片段长度。足够短，减少测序工作，且便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对存在DNA降解的材
料(如：保存已久的腊叶标本、处理过的民间药材)；降低测序费用；不同物种间序列长度变异尽可能小。
5.4 片段通用性。存在保守区域，便于设计通用引物。也可以从已发表的基因组、转录组数据中筛
选合适的DNA片段作为特定物种的条形码。
6 DNA提取技术和保存方法
6.1 CTAB法。对少数富含次生代谢物质或油脂的物种(如樟科、桑科植物)，在CTAB程序之前增加
冰浴步骤以消除影响。详见附录I。
6.2 试剂盒法。一般推荐离心柱型，具体操作步骤可在所用试剂盒说明书上获得。
6.3 DNA保存方法。所有提取出的DNA，经过电泳检测之后，一部分保存在-80℃冰柜长期保存备
用，一部分放置在-20℃冰箱中用于后续实验。
7 PCR扩增及测序
7.1 PCR扩增反应体系(如下表)。
7.2 PCR扩增反应策略。根据引物测序长度，PCR扩增反应策略可分为两类；具体如下表。
7.3 序列测定策略
测序使用ABI系列自动测序仪(Applied Biosystems, Foster City, California, USA)。测序引物使用 PCR
扩增引物。测序时需提供PCR产物和相应引物(引物需提供正反方向)。为了验证测序的准确性或材料受
到污染的准确性，每一条序列均在GenBank中进行比对。详见附录II。
7.4 常用DNA条形码片段测序引物对。针对群落水平林木DNA条形码研究，国际通用的主要有rbcL、
matK和ITS(或ITS2)等引物对，根据需要可增加trnH-psbA。详见附录III。
8 序列编辑方法
对于一个反应(单向序列)可以完成的个体，使用Chromas 2.13软件(Technelysium, Helensvale,
BioEdit或DNAStar的Seqman 5.3软件(Lasergene, Madison, USA)，选定一个方向作标准，双向校准序列，
编辑后保存为FASTA格式文档。条件允许的情况下，建议全部双向测序，以保证准确性。所得序列可
提交至GenBank中，并获得相应的序列号以供使用与核查。对于已初步编辑好的DNA序列，可导入
phylotools软件，获取群落水平上的系统发育关系，进而用于群落系统发育分析。详见附录IV。
9 系统发育关系构建方法
利用植物DNA条形码数据，可根据数据量大小、物种的亲缘关系、所需系统发育树精确程度等条
件，选择合适的构树方法。基于距离的方法在计算上通常快于基于性状的方法，并且很容易应用于分析
不同类型的数据。详见附录V。
9.1 非加权配对算术平均法 Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA)
一种较常用的聚类分析方法，最早是用来解决分类问题的。当用来重建系统发生树时，其假定的前
提条件是：在进化过程中，每一世系发生趋异的次数相同，即核苷酸或氨基酸的替换速率是均等且恒定
的。通过 UPGMA 法所产生的系统发生树是物种树的简单体现。该方法是基于分子钟假定的，并且生
成有根树，可用于群体数据。
9.2 最小二乘法 Least-squares (LS)
将成对距离矩阵作为给定数据，通过匹配那些尽可能近的距离来估计一棵进化树上的枝长，即对给
定的和预测的距离差的平方和最小化。
9.3 邻接法 Neighbor-joining (NJ)
一种快速的聚类方法，不需要关于分子钟的假设，不考虑任何优化标准，基本思想是进行类的合并
时，不仅要求待合并的类是相近的，而且要求待合并的类远离其他的类，从而通过对完全没有解析出的
星型进化树进行分解，来不断改善星型进化树。
9.4 最大简约法 Maximum parsimony (MP)
是一种常使用于系统发生学分析的方法，根据离散型性状包括形态学性状和分子序列(DNA，蛋白
质等)的变异程度，构建生物的系统发育树，并分析生物物种之间的演化关系。在最大简约法的概念下，
生物演化应该遵循简约性原则，所需变异次数最少(演化步数最少)的演化树可能为最符合自然情况的系
统树。在具体的操作中，分为非加权最大简约分析(或称为同等加权)和加权最大简约分析，后者是根据
性状本身的演化规律(比如DNA不同位点进化速率不同)而对其进行不同的加权处理。
9.5 最大似然法 Maximum likehood (ML)
一个比较成熟的参数估计的统计学方法，在系统发生树重建方法中属于一类完全基于统计学构树的......
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