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| 标准编号 | NY/T 1663-2008 (NY/T1663-2008) | | 中文名称 | 乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 | | 英文名称 | Determination of ��-lactoglobulin content in milk and dairy products SDS-PAGE electrophoresi | | 行业 | 农业行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B45 | | 国际标准分类 | 67.120.01 | | 字数估计 | 8,895 | | 发布日期 | 2008-07-14 | | 实施日期 | 2008-08-10 | | 引用标准 | GB/T 6682 | | 标准依据 | 农业部公告第1062号 | | 发布机构 | 中华人民共和国农业部 | | 范围 | 本标准规定了乳与乳制品中β-乳球蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳测定方法。本标准适用于乳与乳制品(生牛乳、奶粉、液态乳、奶酪、乳清粉)中β-乳球蛋白的测定。本标准液态样品的检出限24 mg/ 100 mL, 固液态和固体样品的检出限240 mg/ 100 g。 | NY/T 1663-2008: 乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳法
NY/T 1663-2008 英文名称: Determination of β-lactoglobulin content in milk and dairy products SDS-PAGE electrophoresis
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 1663- 2008
乳与乳制品中戶-乳球蛋白的测定
聚丙嫌酰胺凝胶电泳法
中华人民共和国农业部 发布
NY/T 1663- 2008
前言
本标准中附录 A为资料性附录。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:农业部食品质量监督检验测试中心(上海）。
本标准主要起草人:孟瑾、黄菲菲、韩奕奕、吴榕、陈美莲、何亚斌、王建军、韩惠雯。
NY/T 1663- 2008
乳与乳制品中办-乳球蛋白的测定
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
1 范 围
本标准规定了乳与乳制品中乳球蛋白的 SDS - PAGE凝胶电泳测定方法。
本标准适用于乳与乳制品(生牛乳、奶粉、液态乳、奶酪、乳清粉)中乳球蛋白的测定。
本标准液态样品的检出限24 mg/100mL，固液态和固体样品的检出限240 mg/100 g。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 原理
试样用 SDS - PAGE凝胶电泳后，用光密度计对/? -乳球蛋白进行测定分析，求得卢-乳球蛋白的含
量。
4 试剂
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂;实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规
定。
4.1 冰醋酸(CH3COOH)
4.2 磷酸(H3P04)
4.3 硫酸鞍{ (NH4 ) 2S04 }
4 .4 过硫酸铵{ (NPUACU
4 .5 甲醇(CH3OH)
4.6 乙醇(C2H5OH)
4.7 丙三醇(C3H803)
4 .8 甘氨酸(C2H5N0 2)
4.9 三羟甲基氨基甲烷(C4 HnN03):生化级
4.10 严巯基乙醇(C2 H6 OS):生化级
4.11 丙烯酰胺(C3 H5 NO)
4.12 N - W-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 生 化 级
4.13 十二烷基磺酸納(C12 H25S03Na):生化级
4.14 队
四甲基乙二胺((：6氏6
):生化级
4.1 5 溴酚蓝(C1 9 H1 0Br4O5S)
4.1 6 考马斯亮蓝 R - 250
4.17 盐酸溶液
4 mol/L，量取36mL浓盐酸(HC1)注人50mL水中，定容至100mL，混勻。
4.18 丙烯酰胺单体贮备液
准确称取 14.55 g丙烯酰胺(4.11),0.45 g N -N'-甲叉双丙烯酰胺(4.12)，先用 40 mL水溶解，搅拌，直至溶液变澄清透明，再用水稀释至50mL，过滤，备用。该备液在 4°C下棕色瓶中可保存一个月。
注:丙烯酰胺单体都是中枢神经毒物，小心操作。
4.19 浓缩胶缓冲液贮备液,1 mol/L，pH 6.8
准确称取 6.06 g三羟甲基氨基甲烷(4.9)，溶解于40 mL水中，用盐酸溶液(4.17)调节 pH至 6.8
后，用水定容至 50 mL，4°C下保存。
4.20 分离胶缓冲液贮备液,1.5 mol/L,pH 8,8
准确称取 9.08 g三羟甲基氨基甲烷(4.9),溶解于40 mL水中，用盐酸溶液(4.17)调节 pH至 8.8
后，用水定容至 50 mL，4°C保存。
4.21 过硫酸铵溶液JOOg/L
准确称取a1 g过硫酸铵a 4)，加1mL水溶解，使用前配制。
4.22 十二烷基磺酸钠溶液，100 g/L
准确称取5 g十二烷基磺酸钠(4.13)，用水溶解定容至 50 mL，室温保存。
4.23 N，N,NfX-四甲基乙二胺溶液，体积分数为 10%量取0.10 mL N，N，N' 四甲基乙二胺(4.14)，加水稀释定容至1.00 mL。
4.24 样品缓冲液，0.08 mol/L
精确称取4 mg溴酚蓝（4.15)，溶解于 5.00 mL水中，分别量取 1.60 mL浓缩胶缓冲液贮备液
(4.19),4.00 mL十二烷基磺酸钠溶液(4.22)、1.20 mLf-巯基乙醇(4.10).2.20 mL丙三醇(4.7)，全
部混合后用水稀释定容至20 mL，4°C保存。
4.25 电极缓冲液，pH 8.3
分别准确称取 3.0 g 三羟甲基氨基甲烷（4.9)、14.4 g甘氨酸（4.8)，加人十二烷基磺酸钠溶液
(4.22)10 mL，调节 pH至 8.3,定容至1 000mL。
4.26 考马斯亮蓝染色液 ,2.5 g/L
称取()• 25 g考马斯亮蓝 R _ 250(4.16)和10 g硫酸铵(4.3)，分别加入 20 mL乙醇(4.6)、10 mL磷
酸(4.2)，溶解混匀，用水定容至100mL。
4.27 脱色液
分别量取75 mL冰醋酸(4.1)、5011甲醇(4.5)、875 mL水，混匀
4.28 乳球蛋白标准溶液，1.00 mg/mL
精确称取 0.01 g 乳球蛋白标准品(纯度>90%)，用样品缓冲液(4.24)定容至10 mL，沸水浴
中加热 3 min〜5 min，在-20°C以下保存。
5 仪器设备
常用实验室仪器及以下各项。
5.1 天平，感量 0.000 lg。
5.2 电泳仪。
5.3 电泳槽，100mmX 83
5.4 光密度扫描仪。
5.5 微量注射器，10/nL。
5.6 离心机，不低于 7000 r/min。
5.7 磁力搅拌器。
5.8 具塞离心试管。
6 分析步骤
6.1 试样制备
6.1.1 液体样品
取1mL样品，依次加入1mL水和2mL样品缓冲液(4.24)，沸水浴加热3min〜5min,磁力搅拌器
(5.7)搅拌 4 h，离心 5 min，去除脂肪，取上清液分装，在-20°C保存，备用。
6.1.2 固体样品
称取1 g样品，精确到 0.1mg，加适量水溶解，定容至10 mL，按 6.1.1操作。
6.2 分离胶制备
按表1配制12%分离胶20 mL，混匀后加入到长、短玻璃板间的缝隙内，约 60 mm〜70 mm 高。沿
高的水，进行水封。约 30 min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界长玻璃板板壁缓慢注人约5
线，则表示凝胶完全聚合。倾倒去水封层的水，再用滤纸条吸去多余水分。
6.3 浓缩胶制备
按表1配制3%浓缩胶10mL，混勻后加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约5
处。轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，约30 min后凝胶聚合，再放置 20 min〜30 min，使凝胶老化。
6 .4 装槽
水平取出梳子，将胶板垂直放入电泳槽中，并灌入新配置的电极缓冲液(4.25)，浸没玻璃板上边缘，
胶板底部不要有气泡。
6 .5 上样
用微量进样器分别加入乳球蛋白标准溶液(4.28)2 pL和试样(6.1)
6.6 参考电泳条件(恒电流）
浓缩胶中浓缩 30 mA;分离胶中分离 30 mA。
6 .7 染色
剥出的凝胶用水清洗三次，浸泡在盛有考马斯亮蓝染色液(4.26)的器皿中，染色12 h。
6 .8 脱色
染色后的凝胶先用水冲洗表面的多余染料，再用脱色液(4.27)浸泡脱色。更换脱色液，至凝胶背景
无色为止。
6 .9 分析
用光密度计对凝胶进行测定分析，根据......
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