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| 标准编号 | SN/T 2978-2011 (SN/T2978-2011) | | 中文名称 | 动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法 | | 英文名称 | PCR method for the detection of chicken components in animal derived products | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | X18 | | 国际标准分类 | 67.120 | | 字数估计 | 8,845 | | 发布日期 | 2011-09-09 | | 实施日期 | 2012-04-01 | | 引用标准 | GB 4789.1; GB/T 5009.1; GB/T 6682; GB/T 14699.1; SN/T 1193 | | 标准依据 | 国质检认(2011)492号;行业标准备案公告2012年第4号(总第148号);认办科函[2015]247号 | | 发布机构 | 海关总署 | | 范围 | 本标准规定了动物源性产品中鸡源性成分检测的PCR方法。本标准适用于动物源性产品中鸡源性成分的定性检测。 | SN/T 2978-2011: 动物源性产品中鸡源性成分PCR检测方法
SN/T 2978-2011 英文名称: PCR method for the detection of chicken components in animal derived products
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN／T２９７８-２０１１
动物源性产品中鸡源性成分
PCR检测方法
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
前 言
本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院。
本标准主要起草人：宗卉、曹琛福、张彩虹、杨俊兴、吕建强、阮周曦、曾少灵、陶虹、孙洁、刘建利、
廖丽珊、卢体康、花群义、秦智锋。
动物源性产品中鸡源性成分
PCR检测方法
１ 范围
本标准规定了动物源性产品中鸡源性成分检测的ＰＣＲ方法。
本标准适用于动物源性产品中鸡源性成分的定性检测。
２ 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB ４７８９．１ 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则
GB/T ５００９．１ 食品卫生检验方法 理化部分 总则
GB/T ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T １４６９９．１ 饲料 采样
ＳＮ/T １１９３ 基因检验实验室技术要求
３ 试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T ６６８２的要求。
３．１ 鸡源性成分检测用引物（对）序列：
上游：５’-ｃｔａｔａａｔｃｇａｔａａｔｃｃａｃｇａｔｔｃａ-３’
下游：５’-ｃｔｔｇａｃｃｔｇｔｃｔｔａｔｔａｇｃｇａｇｇ-３’
３．２ 裂解液（参见附录Ａ）。
３．３ 电泳缓冲液（参见附录Ａ）。
３．４ 溴化乙锭（１０ｍｇ／ｍＬ）（参见附录Ａ）。
３．５ 阳性对照样品：采用已知含有鸡源性成分的样品。
３．６ 阴性对照样品：采用已知不含鸡源性成分的样品。
３．７ 空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。
４ 仪器设备
４．１ 离心机（最大转速１４０００ｒ／ｍｉｎ）。
４．２ 微量移液器（１００μＬ～１０００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，２μＬ～２０μＬ，０．５μＬ～１０μＬ）。
４．３ 电泳仪。
４．４ 凝胶成像仪。
４．５ 恒温水浴锅（０℃～１００℃）。
５ 试样选取与制备
根据不同的样品，饲料样品按照GB/T １４６９９．１采样，或若粒度为２０目称取２００ｍｇ，６０目称取
１００ｍｇ，１００目称取５０ｍｇ。食品样品按照GB/T ５００９．１和GB ４７８９．１采样。
将实验室样品研磨待用。
６ 检验步骤
６．１ 样品DNA提取
称取上述混匀样品５０ｍｇ于１．５ｍＬ离心管中，加入６００μＬ～８００μＬ裂解液，６５℃３０ｍｉｎ，期间不时
振荡混匀；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；转移上清液于洁净离心管中，加４００μＬ三氯甲烷／异戊醇（２４∶１），混
匀；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液；加０．８倍体积异丙醇，沉淀；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液；
７５％乙醇洗涤一次，晾干；加入５０μＬ双蒸水（ｄｄＨ２Ｏ）溶解沉淀，制成ＤＮＡ溶液，待用。
也可用等效ＤＮＡ提取试剂盒提取样品ＤＮＡ。
６．２ PCR扩增
反应体系：体积为２５μＬ，包括２×ＰＣＲ缓冲液１２．５μＬ、ｄＮＴＰｓ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）５μＬ、引物对（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）各
０．５μＬ、ＤＮＡ聚合酶（１Ｕ／μＬ）１μＬ、模板ＤＮＡ（１００ｎｇ±５０ｎｇＤＮＡ）５μＬ、双蒸水０．５μＬ。
反应条件：ＰＣＲ反应条件随不同的ＰＣＲ仪略有改变。９４℃预变性１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ～
６０ｓ，６３℃退火３０ｓ～６０ｓ，７２℃延伸３０ｓ～６０ｓ，３５个循环；７２℃延伸５ｍｉｎ；４℃保存。
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。
６．３ PCR扩增产物电泳检测
称取１．５ｇ琼脂糖于１００ｍＬ电泳缓冲液中，加热，充分溶化后，加入溴化乙锭至终浓度为０．５μｇ／ｍＬ，
制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将８μＬ各ＰＣＲ扩增产物分别和３μＬ加样
缓冲液混合，点样。９Ｖ／ｃｍ恒压，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。凝胶成像仪下观察电泳结果
并记录。
６．４ 测序
当电泳结果出现可疑阳性时，将ＰＣＲ扩增产物进行ＤＮＡ测序。
７ 结果判断与表述
７．１ PCR扩增产物电泳并序列分析
实验在阳性对照出现１３１ｂｐ大小的条带，阴性对照无该条带出现、空白对照无条带出现时，视为该
实验成立。在实验成立的前提下，样品出现１３１ｂｐ左右大小的扩增产物则判为可疑阳性，否则为阴性。
将可疑阳性的ＰＣＲ扩增产物进行核酸序列测定，与ＧＥＥＮＢＡＮＫ中鸡线粒体ＤＮＡ相对应片段的
序......
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