SN/T 5107-2019 相关标准英文版PDF

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SN/T 5107-2019	英文版	259	SN/T 5107-2019	[PDF]天数 <=3	出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法	SN/T 5107-2019	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5107-2019 (SN/T5107-2019)
中文名称	出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法
英文名称	(Method for detecting multi-pathogen gene suspension chip of mosquito-borne infectious diseases at entry and exit ports)
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C62
国际标准分类
字数估计	12,184
发布日期	2019-09-03
实施日期	2020-03-01
标准依据	海关总署公告2019年第142号
发布机构	海关总署

SN/T 5107-2019: 出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法 SN/T 5107-2019 英文名称: (Method for detecting multi-pathogen gene suspension chip of mosquito-borne infectious diseases at entry and exit ports) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法中华人民共和国海关总署发布前言本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国石家庄海关。本标准主要起草人：李云、史玲莉、闫冀焕、沈军、李薇、兰景、付晓昀。出入境口岸蚊媒传染病多种病原体基因悬浮芯片检测方法１　范围本标准规定了用于出入境口岸快速筛查黄热病毒、基孔肯雅病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、登革病毒（Ⅰ～Ⅳ型）、疟原虫（间日疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫）６种口岸重点关注的蚊媒病原体的基因悬浮芯片筛查方法。本标准适用于国境口岸入出境人员或蚊类携带以上六种病原体的筛查。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB １９４８９　实验室　生物安全通用要求ＳＮ/T ２７８８　医学媒介生物样品保存与运送要求ＷＳ２３３　微生物和生物医学实验室生物安全通用准则４　生物安全防护要求４．１　实验室应遵循 GB １９４８９和ＷＳ２３３对生物安全Ⅱ级（ＢＳＬ-２）实验室的生物安全要求。４．２　使用过的实验用品应遵照GB １９４８９的要求，对废弃物应进行无害化处理。５　对象５．１　出入境口岸截获的来自蚊媒传染病流行国家或地区人员的可疑病例样本。５．２　出入境口岸截获来自蚊媒传染病流行国家或地区的蚊类样本。６　样本的采集、保存和运送６．１　样本采集６．１．１　采集来自于疫区的人员、出入境可疑人员、申请检验人员的血液。６．１．２　采集来自疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊类或以其他方式藏匿的蚊类样本。６．２　样本的送检和处理６．２．１　蚊类样本：将采集的蚊类直接放入-２０℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按３０只一份，装入２ｍｌ螺口塑料管内，于-７０℃运输或保存待检。６．２．２　血清和血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中处理，编号备用。７　主要设备与试剂７．１　主要设备悬浮芯片系统、荧光显微镜、水平电泳仪、凝胶成像系统、离心机、ＰＣＲ仪、生物安全柜、移液器、核酸蛋白检测仪、真空泵、涡流振荡仪。７．２　主要试剂ＭＥＭ和Ｈａｎｋ’ｓ液、标本处理液（见附录Ａ中Ａ．１）、ＰＣＲ反应液（见附录Ａ中Ａ．２）、氯化四甲铵（ＴＭＡＣ）、１．５× ＴＭＡＣ杂交液（见附录Ａ中Ａ．３）、１×ＴＭＡＣ杂交液（见附录Ａ中Ａ．４）、羧基化编码微球（ＢｉｏＲａｄ公司）、２［Ｎ-吗啉］乙磺酸（ＭＥＳ）（ｐＨ４．５）、１-（３-二甲氨基丙基）-３-乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ）、ＳＤＳ、Ｎ-十二烷基肌氨酸钠、ＴＥ（ｐＨ８．０）（见附录Ａ中Ａ．５）、链亲和素-藻红蛋白（ＳＡ-ＰＥ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、７５％乙醇、Ｔｒｉｚｏｌ、三氯甲烷、吐温-２０、随机引物、ＡＭＶ逆转录试剂盒、２０％螯合树脂Ｃｈｅｌｅｘ１００。８　检测方法８．１　DNA提取８．１．１　从血样本中提取疟原虫ＤＮＡ的方法８．１．１．１　取２０μＬ全血放入１．５ｍＬ离心管内。８．１．１．２　加２００μＬ预热的５％Ｃｈｅｌｅｘ１００，１００℃加热１０ｍｉｎ，期间振荡３次～５次。８．１．１．３　１２０００ｇ离心３ｍｉｎ，取上清液至一干净的０．５ｍＬ离心管中，４℃或-２０℃保存备用。８．１．２　从蚊类样本中提取疟原虫DNA的方法８．１．２．１　将待检蚊类样本在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆２０ｓ～３０ｓ，使样品匀浆成糊状，１２０００ｇ离心３ｍｉｎ，取上清液作为样品。８．１．２．２　加入１５０μＬ重蒸水和５０μＬ的２０％Ｃｈｅｌｅｘ１００，９５℃加热１０ｍｉｎ，以提取ＤＮＡ。８．１．２．３　在加热过程中，每２ｍｉｎ涡旋一次。８．１．２．４　１２０００ｇ离心此混合物３ｍｉｎ，取上清液至一干净的０．５ｍＬ离心管中，４℃或-２０℃保存备用。８．２　RNA提取８．２．１　将待检蚊类样本从-７０℃容器中取出，在冰上操作，倒入研磨器中，加入Ｈａｎｋ’ｓ液１ｍＬ吹洗，弃去液体后加入１ｍＬ标本处理液，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸入１．５ｍＬｅｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管，配平后置预冷４℃的离心机上，２００００ｇ离心１０ｍｉｎ。取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在-７０℃冰箱以备复查。８．２．２　取灭菌的１．５ｍＬ离心管加入１ｍＬ裂解液Ｔｒｉｚｏｌ，然后分别加入８．２．１处理后的被检样本３００μＬ，再加入２００μＬ三氯甲烷，充分振荡均匀（如使用旋涡振荡器，避免振荡过于强烈产生乳化层）。在４℃条件下，１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。８．２．３　将上步离心后样品的上清液５００μＬ转移至新的１．５ｍＬ灭菌的离心管，加入４００μＬ预冷的异丙醇，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。-２０℃冰箱静置３０ｍｉｎ。８．２．４　１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，每管加入５００μＬ７５％乙醇，颠倒洗涤。８．２．５　１２０００ｇ离心１０ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，吸去残余液体，室温下干燥５ｍｉｎ。８．２．６　将抽提的ＲＮＡ溶解在２０μＬＤＥＰＣ水中待用。８．３　PCR扩增８．３．１　逆转录合成犮DNA 以随机引物作为逆转录引物，选择商品化逆转录试剂盒，按试剂说明书操作，以病毒ＲＮＡ为模板合成ｃＤＮＡ。８．３．２　多重PCR扩增８．３．２．１　多重ＰＣＲ扩增引物的选择：扩增引物设计方法见附录Ｂ表Ｂ．１，以随机引物合成的ｃＤＮＡ为模板。８．３．２．２　西尼罗病毒ＰＣＲ反应体系见表１。８．３．２．３　黄热病毒、登革病毒Ⅰ型、登革病毒Ⅳ型多重ＰＣＲ反应体系见表２。８．３．２．４　基孔肯雅病毒、日本脑炎病毒、登革病毒Ⅱ型、登革病毒Ⅲ型、疟原虫多重ＰＣＲ反应体系见表３。８．３．２．５　阴性对照、阳性对照选择：同时应设置本底对照以水代替样品模板ＤＮＡ和ＲＮＡ；阴性对照以非目标病原体的ＲＮＡ和ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应的模板；阳性对照以含有检测序列的ＤＮＡ作为ＰＣＲ反应模板ＤＮＡ。８．４　探针与羧化微球的偶联８．４．１　探针（序列见表Ｂ．２）的５’端连上２０个ｐｏｌｙ（Ｔ），氨基化修饰，将氨基化修饰的寡核苷酸探针溶解于蒸馏水中使其终浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ。８．４．２　将１ｍＬ包装中的羧基化编码微球振荡３０ｓ，超声３０ｓ，至将微球打散。８．４．３　取１００μＬ小球至１．５ｍＬＥＰ管，１４０００ｇ离心４ｍｉｎ，小心吸出上清液。８．４．４　微球重悬于５０μＬｐＨ４．５的０．１ｍｏｌ／ＬＭＥＳ中，振荡２０ｓ，超声２０ｓ。８．４．５　用蒸馏水将１０ｍｍｏｌ／Ｌ的寡核苷酸探针１０倍稀释，将２μＬ１０倍稀释的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀。８．４．６　向每个１．５ｍＬＥＰ管中加入２．５μＬ新鲜配制的１０ｍｇ／ｍＬ的ＥＤＣ溶液，振荡混匀。置涡流振荡器上，室温避光孵育３０ｍｉｎ。８．４．７　再加入２．５μＬ、新鲜配制的ＥＤＣ溶液，振荡混匀。再次置涡流振荡器上，室温避光孵育３０ｍｉｎ。８．４．８　反应结束后，１４０００ｇ离心４ｍｉｎ，小心吸弃上清液。８．４．９　向各个１．５ｍＬＥＰ管中加入１ｍＬ０．０２％吐温-２０，振荡混匀。１４０００ｇ离心４ｍｉｎ，小心吸弃上清液。８．４．１０　向各个１．５ｍＬＥＰ管中加入１ｍＬ０．１％ＳＤＳ，振荡混匀，１４０００ｇ离心４ｍｉｎ，吸弃上清液。向１．５ｍＬＥＰ管中加入１００μＬｐＨ８．０ＴＥ，振荡１０ｓ，超声１０ｓ，使微球重悬。８．４．１１　微球的计数：用血球计数板计数。吸取适量微球，稀释后，用血球计数板（０．１０ｍｍ；１／４００ｍｍ２）在普通光学显微镜下计数。计算公式见式（１），记录微球浓度。微球数量＝每个大格数×１０４×稀释倍数×体积（ｍＬ）（１）８．４．１２　用血球计数板计数后微球原液４℃保存备用。８．５　杂交８．５．１　偶联探针的微球各约３５００个～５０００个混于３３μＬ１．５× ＴＭＡＣ杂交液中，置于０．２μＬ离心管中。８．５．２　向各管中分别加５μＬ～１７μＬ上述８．３中ＰＣＲ扩增产物使其终体积为５０μＬ，吹打混匀。８．５．３　同时一管中加入５μＬ～１７μＬＴＥ使其终体积为５０μＬ，吹打混匀，检测结果作为检测空白对照的荧光值。８．５．４　９５℃变性１０ｍｉｎ。５５℃温度下杂交３０ｍｉｎ。转移至滤板抽滤去掉未结合的ＰＣＲ产物。８．５．５　向各孔加７５μＬ４ｎｇ／μＬＳＡ-ＰＥ的１× ＴＭＡＣ液，室温避光孵育１０ｍｉｎ，抽滤去掉未结合的ＳＡ-ＰＥ。８．５．６　向各孔加入７５μＬ１× ＴＭＡＣ溶液，振荡使微球重悬。８．６　测定荧光值把滤板放入悬浮芯片检测仪器中进行荧光值的测定。８．７　结果判定８．７．１　质控反应结果应同时符合以下四个条件，否则实验结果无效： ---本底对照荧光值应接近于空白对照的荧光值； ---联结探针微球的质控的检测荧光值应远大于空白对照荧光值（１０倍以上）； ---阴性质控为ＰＣＲ扩增时的阴性对照，检测荧光值应接近于本底荧光值； ---阳性质控为ＰＣＲ扩增时的阳性对照，检测荧光值应远远大于阴性质控荧光值。８．７．２　结果判定８．７．２．１　以每种病毒特异性核酸探针的阴......

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