SN/T 5108-2019 相关标准英文版PDF

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SN/T 5108-2019	英文版	179	SN/T 5108-2019	[PDF]天数 <=3	国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法	SN/T 5108-2019	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5108-2019 (SN/T5108-2019)
中文名称	国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法
英文名称	(Method for detecting HRMA of rotavirus, astrovirus, norovirus and Zaru virus in border port)
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C62
国际标准分类
字数估计	8,818
发布日期	2019-09-03
实施日期	2020-03-01
标准依据	海关总署公告2019年第142号
发布机构	海关总署

SN/T 5108-2019: 国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法 SN/T 5108-2019 英文名称: (Method for detecting HRMA of rotavirus, astrovirus, norovirus and Zaru virus in border port) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法中华人民共和国海关总署发布前言本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关，深圳市计量质量检测研究院。本标准主要起草人：汪海波、莫秋华、杨泽、兰全学、杨国武、史咏梅、涂承宁、林继灿。国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒四联HRMA检测方法１　范围本标准规定了国境口岸轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒这四种病毒的检验对象、方法、结果报告、生物安全要求及阳性结果判定。本标准适用于入出境人员携带轮状病毒、星状病毒、诺如病毒、札如病毒的实验室检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB １９４８９　实验室生物安全通用要求ＷＳ/T ２３０　临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用ＳＮ/T １１９３　基因检验实验室技术要求ＳＮ/T １７２０　出入境口岸轮状病毒感染监测规程人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部２００６年制定）４　缩略语下列缩略语适用于本文件： ---ｂｐ：ｂａｓｅｐａｉｒ，碱基对； ---ＤＥＰＣ：ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ，焦碳酸乙二酯； ---ＨＲＭＡ：ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ，高分辨率熔解曲线分析； ---ＰＡＧＥ：ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，聚丙烯酰胺凝胶电泳。５　检测对象５．１　出入境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。５．２　其他申请检验的人员。６　生物安全和PCR防污染要求实验室生物安全应符合GB １９４８９的规定。按照《人间传染的病原微生物名录》，这四种病毒的危害程度均为第三类，可在生物安全二级实验室进行相关操作。ＰＣＲ防污染措施按ＷＳ/T ２３０和ＳＮ/T １１９３的规定执行。７　主要仪器本方法所用的主要仪器如下： ---二级生物安全柜； ---台式高速冷冻离心机（最高离心力１２０００ｒｐｍ以上）； ---旋涡振荡器； ---冰箱：４℃、-２０℃和-７０℃； ---超净工作台； ---微型离心机； ---Ｒｏｔｏｒ-ＧｅｎｅＱＰＣＲ热循环仪（带高分辨率熔解曲线分析模块）；注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 ---微波炉； ---高压灭菌锅； ---超纯水器或双蒸水器； ---微量可调移液器一套（含以下５种规格：２．５μＬ、２０μＬ、１００μＬ、２００μＬ、１ｍＬ）。８　主要试剂８．１　无ＲＮＡ酶的ＤＥＰＣ水。８．２　ＲＴ-ＰＣＲ引物应为ＰＡＧＥ以上级别纯化，引物序列见９．２．３．１。８．３　ＲＴ-ＰＣＲ基础试剂：宝生物工程（大连）有限公司ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＯｎｅＳｔｅｐＲＴ-ＰＣＲＫｉｔ。注：给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。８．４　ＥｖａＧｒｅｅｎ荧光染料。９　检验程序９．１　样品采集粪便标本和呕吐物标本的采集按照ＳＮ/T １７２０执行。９．２　实验室检验９．２．１　样品预处理取黄豆大小约１００ｍｇ的粪便标本或呕吐物，或１００μＬ水样便，加入９００μＬ的生理盐水，剧烈振荡混匀，制成１０％的悬液；然后４℃，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；转移上清至灭菌的干净离心管。不能立即进行检测时，样本冻存于-７０℃超低温冰箱备用。９．２．２　病毒核酸提取取９．２．１预处理好的样本１００μＬ，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ液，振荡混匀后室温静置５ｍｉｎ，然后加入２００μＬ氯仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡混匀１５ｓｅｃ后室温静置５ｍｉｎ，４℃，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层水相至另一离心管中，加入５００μＬ异丙醇沉淀ＲＮＡ，充分混匀后室温放置１０ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液，再加入１ｍＬ的７０％乙醇洗涤一次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，室温放置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ后加入５０μＬＤＥＰＣ水（或其他核酸溶解液）溶解核酸沉淀，分装后于-７０℃条件下保存，备用。９．２．２．２　试剂盒提取核酸法按适用于病毒基因组提取的商品试剂盒说明书操作。９．２．３　四重高分辨率熔解曲线检测９．２．３．１　引物引物序列分别见表１。９．２．３．２　标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照设置检测过程中分别设标准品、阳性对照、阴性对照和空白对照。标准品为克隆的轮状病毒、星状病毒、诺如病毒和札如病毒部分核苷酸序列（必须包含扩增区域在内）在体外转录合成的ＲＮＡ；阳性对照为留存的这４种病毒的阳性样本的核酸或体外转录合成的ＲＮＡ；阴性对照为正常人大便提取的核酸；空白对照为无菌水。９．２．３．３　反应体系组成反应体系组成见表２。９．２．３．４　反应条件反应条件为：４２℃ 反转录５ｍｉｎ；９５℃预变性１０ｓｅｃ；９５℃变性１０ｓｅｃ，６０℃退火／延伸３０ｓｅｃ，４０个循环；设置温度从６５℃逐渐上升至９５℃，上升速率为０．１℃／ｃｙｃｌｅ。因不同ＰＣＲ仪器的性能差异，可根据条件优化适当调整反应条件。９．２．３．５　高分辨率熔解曲线分析用仪器自带的软件对生成的熔解曲线进行分析，将阳性对照／阴性对照／空白对照／样本的熔解曲线同标准品的熔解曲线进行对比。阳性样本的曲线为典型的单一尖峰，而阴性样本的曲线为均一直线，无熔解峰。９．２．４　检验结果判断及报告当阳性对照的熔解曲线同各标准品的一致，而阴性对照／空白对照的为均一直线时才可对样本进行结果判断及报告，否则视为实验失败，需重新实验。本标准检验结果判断及报告如下：ａ）　检验样品的熔解曲线同轮状病毒标准品的一致，报告“检出轮状病毒特异性基因（ＨＲＭＡ法）”；ｂ）　检验样品的熔解曲线同星状病毒标准品的一致，报告“检出星状病......

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