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| 标准编号 | SN/T 5203-2020 (SN/T5203-2020) | | 中文名称 | 鱼类物种鉴定 基因条形码的检测技术规范 | | 英文名称 | (Fish species identification genetic bar code detection technical specifications) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 14,154 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5203-2020: 鱼类物种鉴定 基因条形码的检测技术规范
SN/T 5203-2020 英文名称: (Fish species identification genetic bar code detection technical specifications)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
中华人民共和国海关总署 发 布
鱼类物种鉴定 基因条形码的检测 技术规范
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海关、深圳华大海洋研究
院、深圳市农产品质量安全检验检测中心。
本文件主要起草人：郑晓聪、王敏、温智清、阚式绂、刘荭、石琼、何俊强、黄玉、于力、王
津津、刘莹、贾鹏、史秀杰、兰文升、秦智锋。
鱼类物种鉴定 基因条形码的检测技术规范
1 范围
本标文件定了鱼类基因条形码鉴定中的样品处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定
等操作程序和规范。
本文件适用于对自然环境种化产生的野生型鱼类或其残存的组织进行物种鉴定, 不适合杂交选育
的品种。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BOLD ：生物条形码数据系统（barcoding of life datasystem）。
5 试剂和材料
5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
5.2 醋酸铵，分析纯。
5.3 乙醇，分析纯。
5.4 异丙醇，分析纯。
5.5 蛋白酶 K，分析纯。
5.6 高保真 DNA 聚合酶、dNTPs （含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、MgSO4、PCR 缓冲液（不含 Mg
2+）
和溴酚蓝等试剂，可选用专业试剂公司提供的商品化试剂。
5.7 引物：用去离子水将每条引物配制成 100 μmol/L 储存液，置-20 ℃以下冻存；使用时取适量配制
成 10 μmol/L 工作液，避免多次冻融。序列见表 1。
5.8 标准分子量：推荐使用 100 bp DNA marker。
5.9 琼脂糖，分析纯。
6 器材与设备
台式离心机、各量程可调移液器、可调式恒温浴、微量核酸蛋白测定仪、超净工作台、PCR 扩
增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。
7 取样
样品包括活鱼、鱼卵、鲜冻的肉块、单一鱼类制作的肉糜等。宜取鲜活的组织，成鱼优先选取肌
肉组织（心、脑、脾、肾、肝、肠、胃等器官也适用），鱼卵取卵膜。如需非致死性取样，剪取部分
鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块 3 mm3～5 mm3 的肌肉块即可。
采集的组织置于冰上低温保存备用，如需长期保存，应置于≤-20 ℃冷冻或置于 75% 乙醇中固定
保存。
8 实验步骤
8.1 设立对照
设置空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含鱼类成分的样品作阳性对照，用已知不含鱼类成
分的样品作阴性对照，用等体积的去离子水代替模板 DNA 作空白对照。
8.2 DNA 提取
取 20 mg 样品组织剪碎置于洁净 1.5 mL 离心管中，加入 600 μL 裂解液（见附录 A 中 A.1）和 20
μL 蛋白酶 K 溶液（见附录 A 中 A.2），混匀，于 56 ℃水浴 1 h～3 h，期间不时轻微振动混匀；待组
织消化完全，冷却至室温，加入 200 μL 醋酸铵溶液（见附录 A 中 A.3），混匀，冰上放置或 4 ℃冷却
5 min～10 min，使蛋白质盐析出来；于 4 ℃，12 000 g 离心 10 min，将上清液转移至另一洁净的
1.5 mL 离心管中，于 4 ℃，12 000 g 离心 10 min，取上清液至另一个洁净 1.5 mL 离心管中，加等体积
异丙醇，轻轻摇匀，4 ℃放置 15 min ；4 ℃，12 000 g 离心 10 min 沉淀 DNA ；弃上清，加 1 mL 75%
乙醇，轻轻混匀，于 4 ℃，12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，晾干；干燥后加入 50 μL 去离子水溶解；
DNA 提取液应置于冰上备用，若需长期保存应置于≤-20 ℃保存。
也可采用经验证可靠的 DNA 提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书使用。
8.3 DNA 浓度和纯度的测定
吸取 DNA 提取液 2 μL，以去离子水作为空白对照，使用 NanoDrop 微量核酸蛋白测定仪测定
DNA 模板的质量浓度及 A260/A280。DNA 的质量浓度根据式（1）计算：
DNA 的质量浓度 = A260×50× 稀释倍数（ng/μL） （1）
提取的 DNA 浓度要求大于等于 5 ng/μL，A260/A280 的比值在 1.7 ～ 1.9 之间。
8.4 PCR 扩增
在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 2 配制反应体系， 加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳
性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。
8.5 琼脂糖电泳
用新鲜配制的 1×TAE 电泳缓冲液（见附录 A 中 A.4）配制含 1 μg/mL 溴化乙锭（见附录 A 中 A.5）
的 2% 琼脂糖凝胶。取适量扩增产物和溴酚蓝指示剂按比例混匀后进行电泳检测，设 DNA Marker 同
步电泳；采用 5 V/cm～8 V/cm，电泳 1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录结果。
8.6 电泳结果
当阳性对照扩增片段大小为 700 bp、阴性对照和空白对照没有扩增片段时，结果成立。此时，若
待测样品出现 700 bp 扩增片段则判断该样品 PCR 扩增结果阳性，无扩增片段或者片段大小不符则判
断为 PCR 扩增结果阴性（参见附录 B）。
8.7 序列测定
将 PCR 扩增结果阳性产物进行序列测定，测序引物使用通用引物 M13F（-20）和 M13R（-27）。
需要时可先进行 PCR 产物的纯化或克隆（参见附录 C）。
8.8 序列有效性分析
通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列（见附录 D 中 D.1）且长度
大于 500 bp 为有效序列。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段后应能得到一个具有完整开放
阅读框的拼接序列，并可翻译成一条完整的蛋白质序列；否则序列仅供参考（见附......
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