SN/T 5325.6-2020 相关标准英文版PDF

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SN/T 5325.6-2020	英文版	339	SN/T 5325.6-2020	[PDF]天数 <=4	出口食品中食源性病毒定量检测数字PCR法第6部分：柯萨奇病毒	SN/T 5325.6-2020	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5325.6-2020 (SN/T5325.6-2020)
中文名称	出口食品中食源性病毒定量检测数字PCR法第6部分：柯萨奇病毒
英文名称	(Quantitative detection of food-borne viruses in exported food. Digital PCR method - Part 6: Coxsackie virus)
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C53
国际标准分类	67.050
字数估计	16,186
发布日期	2020-12-30
实施日期	2021-07-01
标准依据	海关总署公告2020年第136号
发布机构	海关总署

SN/T 5325.6-2020 (Quantitative detection of food-borne viruses in exported food.Digital PCR method -- Part 6: Coxsackie virus) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法第 6 部分：柯萨奇病毒 Digital PCR method for quantitative detection of foodborne viruses in export foods Part 6: Coxsackie virus 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 67.050 CCS X 04 中华人民共和国海关总署发布前言 SN/T 5235-2020《出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法》共分为 7 个部分：第 1 部分：诺如病毒；第 2 部分：甲型肝炎病毒；第 3 部分：轮状病毒；第 4 部分：札如病毒；第 5 部分：星状病毒；第 6 部分：柯萨奇病毒；第 7 部分：脊髓灰质炎病毒。本部分为 SN/T 5235-2020 的第 6 部分。本部分根据 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海海关、中华人民共和国北京海关。本部分主要起草人：黄新新、李想、杨娟、何宇平、蒋原、吴頔、曾静、徐蕾蕊、印丽萍。出口食品中食源性病毒定量检测数字 PCR 法第 6 部分：柯萨奇病毒 1 范围本部分规定了贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中柯萨奇病毒的数字 PCR 检测方法。本部分适用于贝类、硬质表面食品、生食蔬菜、软质水果等食品中柯萨奇病毒的定量检测。本方法所能达到的检测限为 1 800 拷贝/2 g（贝类消化腺）；1 800 拷贝/100 cm2（硬质表面食品）； 3 600 拷贝/25 g（生食蔬菜和软质水果）。本方法所能达到的定量限为 3 600 拷贝/2 g（贝类消化腺）；3 600 拷贝/100 cm2（硬质表面食品）； 7 200 拷贝/25 g（生食蔬菜和软质水果）。 2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析试验用水规格和试验方法。 3 术语、定义和缩略语下列术语和定义适用于本文件。 3.1 检测限 imit of determination（LOD）方法所能检测样品中最低的柯萨奇病毒基因含量。 3.2 定量限 limit of quantification（LOQ）在相对标准偏差不超过 25% 的条件下，方法所能定量检测的样品中最低柯萨奇病毒基因含量。 3.3 微反应体系 tiny reaction system 将含有模板、引物/探针、Taq 酶及其缓冲液充分混匀后分配至体积相同且相互物理隔离的油包水液滴或其它微孔、微室中所形成的小体积荧光 PCR 反应体系。 3.4 过程质控物质 process control 通过添加与目的病毒类似的外源质控物质如 MS2 噬菌体，来监测整个检测过程，通过对最终过程质控物质回收率的计算来评估检测过程的有效性和计算样品中病毒的实际含量。 3.5 外部控制 RNA external control RNA (EC RNA) 外源阳性对照 RNA，作为数字 PCR 过程的阳性对照。 3.6 有证标准物质 certified reference material 附有权威机构出具的证书，说明使用程序，获得具有相关不确定度和溯源性的一个或多个特性值的标准物质。 3.7 缩略语 3.7.1 CV（Coxsackie virus）：柯萨奇病毒。 3.7.2 CV-A6（Coxsackie virus-A6）：柯萨奇 A6 型病毒。 3.7.3 CV-A10（Coxsackie virus-A10）：柯萨奇 A10 型病毒。 3.7.4 CV-A16（Coxsackie virus-A16）：柯萨奇 A16 型病毒。 3.7.5 CV-B2（Coxsackie virus-B2）：柯萨奇 B2 型病毒。 3.7.6 PC（process control）：过程质控。 3.7.7 EC RNA（external control RNA）：外源控制 RNA。 3.7.8 pfu（plaque forming unit）：噬斑形成单位。 4 原理数字 PCR（digital PCR）是在荧光 PCR 基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数测定。通过将含有模板、引物/探针、Taq 酶及其缓冲液的荧光 PCR 反应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于 10 000 个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配至微反应体系中。所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行 PCR 扩增反应后，根据设定的荧光阈值判断每个微反应体系的扩增结果。依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR 反应体系中的模板浓度。 5 设备及材料 5.1 数字 PCR 系统：包括微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能仪器的系统。 5.2 核酸定量仪：Nanodrop3 000 或 Modulus 检测仪或其他核酸定量检测仪。 5.3 冷冻离心机。 5.4 生物安全柜。 5.5 低温冰箱：-80 ℃冰箱，-20 ℃冰箱。 5.6 天平：感量为 0.1 g。 5.7 均质器。 5.8 涡旋振荡仪。 5.9 高压灭菌锅。 5.10 恒温孵育器/箱：控温精度 ±1.0 ℃。 5.11 微量移液器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、10 μL～100 μL、0.5 μL～10 μL、0.1 μL～2.5 μL。 5.12 数字 PCR 微反应体系生成联排管及覆膜或芯片。 5.13 网状过滤袋：400 mL。 5.14 无菌棉拭子。 5.15 无菌剪刀。 5.16 无菌钳子。 5.17 无菌培养皿。 5.18 无 RNase 和 DNase 污染的玻璃容器。 5.19 无 RNase 离心管、无 RNase 移液器吸嘴、无 RNase 药匙、无 RNase PCR 薄壁管。 6 试剂所有实验用试剂均为分析纯，符合 GB/T 6682 的要求；除特别说明外，实验用水为无 RNase 超纯水。 6.1 一步法数字 RT-PCR 反应预混液。 6.2 果胶酶：来源于黑曲霉（Aspergillus niger）或棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）。 6.3 PC 物质，制备及定量方法见附录 A。 6.4 EC RNA ：制备及定量方法见附录 B。 6.5 Tris/甘氨酸/牛肉浸膏（TGB E）缓冲液：见 C.2.2。 6.6 5×PEG/NaCl 溶液：见 C.2.3。 6.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：见 C.2.4。 6.8 氯仿/正丁醇混合液：见 C.2.5。 6.9 蛋白酶 K 溶液：见 C.2.6。 6.10 75% 乙醇：见 C.2.7。 6.11 Trizol 试剂：见 C.2.8。 6.12 引物和探针：根据表 1 的序列合成引物和探针，加入无 RNase 超纯水配制成 10 µmol/L 浓度。扩增序列参见附录 D。表 1 数字 PCR 检测的引物和探针病毒名称引物和探针序列（方向 5’-3’）扩增片段大小（bp）参考毒株基因序列号及扩增基因位置 CV-A6 CV-A6-F（上游引物）：CAA GCT GCA GAA ACG GGA G CV-A6-R（下游引物）：GCT CCA CAC TCG CCT CAT T CV-A6-P（探针）：VIC-CCG TTT CGA TTC ATC A-MGB 103 AB649286，（130-232） CV-A10 COXA10-F（上游引物）：CTC GTC CGT ACA TGC TGC A COXA10-R（下游引物）：TGC AGG AGG GTC AGT GAG TT COXA10-P（探针）：FAM-TT+T+CAA TGG CAA A+C+A GCA AC-BHQ1 128 GenBank 登录号： AB598061，（273-400） CV-A16 CV-A16-F（上游引物）：AGA CKA GAT GTG TGT TGA ACC ATC AC CV-A16-R（下游引物）：TGT ACC CGT RGT GGG CAT TGT CV-A16-P（探针）：FAM-TCC ACR CAG GAG ACR GCC ATT GG-BHQ1 107 GenBank 登录号： JF738004，（2555-2661）表 1（续）病毒名称引物和探针序列（方向 5’-3’）扩增片段大小（bp）参考毒株基因序列号及扩增基因位置 CV-B2 CV-B2-F（上游引物）：AGT AAA AAT GCY RCC AAA GAR A CV-B2-R（下游引物）：TTC TTC TYA GTT GSG CRG CT CV-B2-P（探针）：VIC-CTA ACA CTC ACY TTC CA-MGB GenBank 登录号： AF081485，（2699-2774） MS2 噬菌体 MS2-TM3-F（正向引物）： GGC TGC TCG CGG ATA CCC MS2-TM3-R（反向引物）： TGA GGG AAT GTG GGA ACC G 202 GenBank 登录号： JF 719743.1 （3135-3336）注 1 ：简并引物：R=A/G，Y=C/T ，S=G/C，K=G/T ；+ 为前一个碱基需加锁核酸。注 2 ：荧光标记： FAM、VIC 代表荧光报告基团，BHQ1、MGB 代表荧光猝灭基团，反应过程中应选择相应的荧光通道。 7 检测程序柯萨奇病毒数字 PCR 定量检测程序见图 1。病毒富集前处理根据过程质控物质的回收率计算样品中甲型肝炎病毒的实际含量 RNA提取和纯化硬质表面食品≤100 cm2 软质水果和生食蔬菜 25 g 贝类消化腺 2.0 g 过程质控物质数字 PCR检测添加确保实验有效空白对照阴性；阴性对照阴性；阳性对照阳性；计算过程质控物质回收率，要求回收率≥1% 静置吸附 30 min 图 1 柯萨奇病毒数字 PCR 定量检测程序 8 操作步骤 8.1 质控物质的选取 8.1.1 PC 物质选择 MS2 噬菌体或其他等效物质作为 CV 检测的 PC 物质。体外培养获得准确的效价（浓度），达到 108 pfu/mL～1011 pfu/mL，分装后保存于 -80 ℃。使用时稀释至 107 pfu/mL～109 pfu/mL。 8.1.2 EC RNA 以含有 CV 检测目的片段的 RNA 作为检测的 EC RNA，-80 ℃保存。也可购买含有 CV 检测目的片段 RNA 的有证标准物质。 8.2 不同食品基质中的病毒富集 8.2.1 软质水果 8.2.1.1 将 25 g 软质水果或生食蔬菜切成约 2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm 的小块（如水果或蔬菜小于该体积，可不切）。 8.2.1.2 在软质水果或生食蔬菜表面添加 10 μL PC 物质，室温静置吸附 30 min。 8.2.1.3 将样品小块移至带有 400 mL 网状过滤袋的样品袋，加入 40 mL TGB E 溶液（软质水果样品，需加入 30 U A.niger 果胶酶或 1 140 U A.aculeatus 果胶酶）。 8.2.1.4 室温下 60 r/min，振荡 20 min。酸性软质水果需在振荡过程中，每隔 10 min 检测 pH，如 pH 值低于 9.0 时，使用 1 mol/L NaOH 调 pH 值至 9.5，每调整一次 pH 值，延长振荡时间 10 min。 8.2.1.5 将振荡液转移至 50 mL 离心管，4 ℃，10 000 r/min，离心 30 min。上清液转移至干净离心管中，用 1 mol/L HCl 调 pH 至 7.0。 8.2.1.6 加入 0.25 倍体积 5 × PEG/NaCl 溶液，摇匀，4 ℃ 过夜或 60 r/min 振荡 60 min。4 ℃,10 000 r/min, 离心 10 min 紧实沉淀，弃上清液，加入 500 μL PBS 悬浮沉淀。 8.2.1.7 对于浆液过多的部分软果类样品，PBS 重悬后，加入 500 μL 的氯仿 - 正丁醇，涡旋混合，室温下孵育 5 min，4 ℃，10 000 r/min, 离心 15 min，取上清液用于提取 RNA。 8.2.2 硬质表面食品 8.2.2.1 向硬表面食品表面添加 10 μL PC 物质，添加面积不大于 100 cm2，室温静置吸附 30 min。 8.2.2.2 将无菌棉拭子使用 PBS 湿润后，用力擦拭食品表面（≤ 100 cm2）。记录擦拭面积。 8.2.2.3 将棉拭子浸入 490 μL PBS 缓冲液中，按压无菌棉，如此重复浸入和挤压 3 次～4 次，确保挤压出最大量的病毒，测定并记录液体 mL 数，用于后续 RNA 提取。 8.2.3 贝类 8.2.3.1 戴上防护手套，使用无菌贝类剥刀打开至少 10 个贝类。 8.2.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺，置于干净培养皿中。收集 2.0 g± 0.2 g 消化腺。 8.2.3.3 向收集的消化腺中添加 10 μL PC 物质，室温静置吸附 30 min。 8.2.3.4 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后，转移至离心管。加入 2.0 mL 蛋白酶 K 溶液，混匀。 8.2.3.5 使用恒温摇床或等效装置，37 ℃，320 次/min，振荡 60 min。 8.2.3.6 将离心管放入水浴或等效装置，60 ℃，15 min。室温 3 000 r/min，离心 5 min，取上清液，用于后续 RNA 提取。注：样品处理一般应在 4 ℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测，如果暂时不能检测应将样品保存在 -80 ℃冰箱中，试验前解冻。样品处理和 PCR 反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可设置 2 个～3 个平行处理。 8.3 病毒 RNA 提取和纯化 8.3.1 病毒裂解将病毒提取液加入离心管，加入病毒提取液等体积 Trizol 试剂，混匀，激烈振荡，室温放置 5 min，加入 0.2 倍体积氯仿，涡旋剧烈混匀 30 s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀），4 ℃ ，12 000 r/min，离心 5 min，上层水相移入新离心管中，不能吸出中间层。 8.3.2 病毒 RNA 提取离心管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置 5 min，4 ℃，12 000 r/min，离心 5 min，弃上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。 8.3.3 病毒 RNA 纯化 8.3.3.1 每次加入等体积 75% 乙醇，颠倒洗涤 RNA 沉淀 2 次。 8.3.3.2 于 4 ℃，12 000 r/min，离心 10 min，小心弃上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干），离心管内残留的上清液用微量加样器吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀，室温干燥 3 min，不能过于干燥，以免 RNA 不溶。 8.3.3.3 加入 100 μL 无 RNase 超纯水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min，离心 5 s，冰上保存备用。注：病毒 RNA 可手工提取和纯化，也可使用商品化病毒 RNA 提取和纯化试剂盒。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套，并经常更换。提取出来的 RNA 立即进行反应，或保存在 4 ℃小于 8 h。如果长期储存建议 -80 ℃保存。 8.4 质量控制 8.4.1 空白对照，以无 RNase 超纯水作为空白对照。 8.4.2 阴性对照，以不含 CV 的食品样品，提取的 RNA，作为阴性对照。 8.4.3 阳性对照，以已知核酸浓度的 EC RNA，作为阳性对照。 8.4.4 PC 物质，以食品中 MS2 RNA 的回收率表示食品中 CV RNA 的回收率，用于评估检测过程的有效性和计算样品中 CV 的实际含量。 8.5 数字 PCR 扩增 8.5.1 RNA 模板稀释病毒 RNA 提取后，根据使用的数字 PCR 平台，选择适宜的稀释倍数进行 RNA 模板稀释，稀释液用于后续定量检测。 8.5.2 PCR 反应体系的设立每个样品设置 3 个平行，反应体系设为双重，分别为 A6、A10 做双重数字 PCR ；A16、B2 做双重数字 PCR。体系为：一步法数字 RT-PCR 反应预混液 8 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1.5 μL， 10 μmol/L 探针各 0.5 μL，RNA 模板 2 μL，补水至反应终体积为 20 μL。 8.5.3 微反应体系生成、数字 PCR 反应扩增及结果读取根据仪器要求，将配制好的数字 PCR 反应混合液，加入微反应体系生成装置的加样孔中，按仪器操作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于 PCR 扩增仪中，按以下参数进行扩增：60 ℃ ， 30 min （1 ℃/s），1 个循环；95 ℃，5 min（1 ℃/s），1 个循环；94 ℃，30 s，55 ℃，1 min（1 ℃/s）， 40 个循环；98 ℃ ，10 min（1 ℃/s），1 个循环；12 ℃ 保存反应产物。对微反应体系进行荧光检测。 9 结果分析与表述 9.1 阈值的设定根据数字 PCR 结果中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限。阈值限需要对阴性和阳性扩增结果进行明显的区分。 9.2 对照组设定阴性对照组和空白对照组内均没有任何扩增现象，阳性对照中对 EC RNA 的检测值应该不超过其理论值的 25%，PC 对照的回收率＞ 1%，有一项不符合则实验重新进行。根据公式（1）计算回收率： B(%)= CMS2×A×V1 C0×V2 ×100% （1）式中： B（%） --回收率，即 PC 物质的检测回收率。 CMS2 -- PC 物质的浓度，即稀释后的 RNA 模板中 PC 物质检测目的片段的拷贝浓度，由 PC 物质的数字 PCR 检测值乘以数字 PCR 反应体系的体积后，除以数字 PCR 反应体系中 RNA 模板的体积计算得出，单位为拷贝每微升。 A -- RNA 模板的稀释倍数。 V1 --提取后的 RNA 模板的体积，单位为微升。 C0 --添加到样品中的 PC 物质的原始浓度，单位为拷贝每微升。 V2 --添加到样品中的 PC 物质的体积，单位为微升。 9.3 检测结果分析和表达 9.3.1 样品结果分析和表达每份样品的三个重复检测结果的相对标准偏差（%）不超过 25% 时，将三个重复检测结果的平均值作为样品的检测结果，记为 CMean（拷贝每微升）。 9.3.2 检测结果计算 9.3.2.1 无 CV 特异性荧光信号，阴性对照组和空白对照组内均没有任何扩增现象，阳性对照中对 EC RNA 的检测值应该不超过其理论值的 25%。PC 对照的回收率＞ 1%，则认为待测样品中不含有 CV，检测结果表述为“未检出柯萨奇病毒”。 9.3.2.2 待测样品有 CV 显著荧光信号，且 3 个平行的 RSD ≤ 25%，则根据公式（2）计算：柯萨奇病毒含量 = CMean×A×V1 （2）检测结果表述为“检出柯萨奇病毒”，含量为：附录 A （规范性） PC 物质的制备 A.1 概要本标准使用 MS2 噬菌体作为 PC 物质，也可使用其他等效，不与 CV 交叉反应的病毒作为 PC 物质。 MS2 噬菌体为正义单链 RNA 病毒，基因组含有 3 569 个核苷酸。MS2 噬菌体能够感染 F+（雄株）大肠杆菌埃希氏菌属，具有可培养和纯化，抗 Dnase 或 Rnase 消化等特点，并可通过计数噬菌斑的方式，确定其效价水平。也可使用商业化 MS2 噬菌体试剂、MS2 噬菌体有证标准物质或试剂盒中的 PC 物质。 A.2 试剂和仪器 A.2.1 MS2 噬菌体（ATCC 15597-B1）。 A.2.2 埃希氏大肠杆菌（ATCC 15597）：埃希氏大肠杆菌（ATCC 15597）是 MS2 噬菌体（ATCC 15597-B1）的宿主菌，推荐使用营养肉汤和营养琼脂进行复苏、分离纯化和增殖。 A.2.3 培养基： a) 底层营养琼脂：普通营养琼脂 b) 上层营养琼脂：胰蛋白胨 10 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖 1.0 g，琼脂粉 6.0 g，2.5 mol/L CaCl2 储备液 10 mL，蒸馏水 1 000 mL，调节 pH 至 7.2。 A.2.4 试剂及仪器:PBS、氯仿、生物安全柜、恒温培养箱等。 A.3 MS2 噬菌体培养及效价测定 A.3.1 MS2 噬菌体的扩增培养埃希氏大肠杆菌（ATCC 15597）冻干粉接种于 5.0 mL 营养肉汤......

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