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| 标准编号 | WS/T 358-2011 (WS/T358-2011) | | 中文名称 | 血清(浆)脂蛋白(a)的免疫测定 | | 英文名称 | Immunoassay of serum or plasma lipoprotein (a) | | 行业 | 卫生行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C50 | | 国际标准分类 | 11.020 | | 字数估计 | 14,147 | | 发布日期 | 2011-12-14 | | 实施日期 | 2012-06-01 | | 标准依据 | 卫通(2011)22号;行业标准备案公告2012年第2号(总第146号) | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | | 范围 | 本标准旨在对临床实验室血清(浆)脂蛋白(a)[lipoprotein(a), Lp(a)]待测标本的采集、处理和储存, 选择科学的方法、试剂及保证测定结果可溯源至参考系统提供了原则;亦可为生产厂商生产Lp(a)测定试剂盒提供参考依据。 | WS/T 358-2011: 血清(浆)脂蛋白(a)的免疫测定
WS/T 358-2011 英文名称: Immunoassay of serum or plasma lipoprotein (a)
ICS 11.020
C50
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
Ws/T 358- 2ˉ011
血清 (浆 )月旨蛋白(a)的免疫测定
1 范围
本标准 旨在对临床实验室血清 (浆 )丹旨蛋 白(a)Elipoprotein(a),Lp(a)]待测标本 的采集 、处理和储
存 ,选择科学的方法 、试剂及保证测定结果可溯源至参考系统提供 了原则 ;亦可 为生产厂商生产 Lp(a)
测定试剂盒提供参考依据 。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件 。
2.1明t刂灾
通过加入可溶性 的反应物除去及 中和另一反应物 。如 :通过加人可溶性 的抗原除去相应的抗体 。
2.2吸附
通过将可溶性物质 (如 抗原、抗体)非特异、非共价地结合于细胞或惰性颗粒 (如塑料、玻璃或胶乳、
皂土、纤维素等)的表面而除去。
2.3抗原 免疫原
能刺激机体免疫系统 ,诱导特异性免疫应答 ,并能与相应的免疫应答产物 (抗体或致敏淋 巴细胞 )在
体 内或体外发生特异性反应 的物质 。
2.4抗体
由浆细胞产生的能与相应抗原发生特异性结合 的免疫球蛋 白。
2.5亲和力
表示受体-配体间内在结合力。在免疫测定中,受体为抗体 ,配体为分析物。
2.6结合力
受体 (如抗体等)结合配体 (如抗原等)的能力。
2.7交叉反应性
由存在的同抗原决定族相似但不等同的免疫原而引起 的抗原-抗体反应 。
2.8等位基因
位于同源染色体的相 同位置上控制某一性状的不同形态的基 因。
2.9多态性
群体内存在和等位基因相关的若干种表现型 ,是单一基因座等位基因变异性在群体水平的体现。
2.10免疫测定
利用抗原-抗体特异性反应建立 的检测相应抗体或抗原 的方法 。
2.11免疫透射 比浊测定
抗原 、抗体在反应体系中快速形成抗原抗体复合物 ,使反应液 中浊度增加 。当一定波长的光线通过
反应样品时被免疫复合物反射 、吸收而减弱 。在一定范 围内 ,透射光被吸收的量与免疫复合物量呈正相
关 ,而复合物量与抗原和抗体 的量亦呈 函数关系 。
2,12酶免疫吸附测定
利用抗原-抗体 的免疫学反应和酶的高效催化功能 的特点 ,具有生物放大作用 ,反应灵敏 。酶 与抗
体 (或抗原)交联后 ,再与结合在 固相支持物表面的相应抗原或抗体反应 ,形成酶标记抗体-抗原复合物 ,
作用于酶底物出现颜色反应 ,液体显色的强弱和酶标记抗体 -抗原复合物 的量成正 比 ,借此反 映 出待检测的抗原或抗体量 。
2.13参考物质
材料或物质 ,其一种或多种特性值足够均匀且已被确定 ,用 于测量系统校准、测量程序评估或为其他物质赋值。
2.14一级参考物质
具有最高计量学特性 、其值由一级参考测量程序确定的参考物质。
2.15二级参考物质
用一级参考物质和参考方法定值的、与样品基质相同或足够相似的参考物质 ,用 于参考方法和常规
测定方法之间的准确性转移 ,亦可用作校准物质。
2.16参考方法
经充分论证具有高精密度和准确度的方法 ,用 于二级参考物质和校准物质的定值及常规方法的评价。
2.17参考系统
由一级参考物质、一级参考方法和参考实验室和/或参考实验室网络组成的系统 ,是常规测定的准确性基础。
2.18工值传递
将特定分析物的量值从较高级别参考物质传递到另一参考物质的一种有效方案。
2.19校准物
在常规测定中作校准用的物质 ,在校准函数中其值作独立变量的参考物质。
2.20产品校准物
用于制造商最终产品的校准物。
3 免疫原
不同来源的抗原问存在着个体 基因型 、异型等特征 ,应保证以其制备的抗体对 临床检测没有影响。
冈此 ,作 为免疫原的材料耍尽可能地代表整体人群样本库 中的各种多态 型 。以免 引起抗 体特 异性 出现偏倚 。
常采用超速离心结合层析技术 .从 混合人血清中提取天然 Lp(a);Lp(a)解离后可再行分离ap°(a)。
新制备的 Lp(a)会发生凝集 ,抗 原性逐渐减弱 。在纯化过程 巾如对脂蛋 白进行脱脂处理 ,脂质含量不 同
Jˉ 影响抗原位点的表达 。以人I合成蛋 白为免疫原制备抗体应保证制备的抗体对临床检测各种 多态 型的样本均无影响 ;作
为参考物质 ,应 证明同天然的 Lp(a)具有相 同的免疫反应性 。
4 抗体 (单 克隆和多克隆抗体 )
4.1 抗体制备
用 Lp(a)纯品免疫动物 (羊 、兔等 )得 到多克隆抗 m清,冉 经吸附 、吸收等除尽抗 ap°B等杂抗体 ,获
得 apo(a)抗血清 ;用 apo(a)免疫动物可直接得到 apo(a)抗血清 。抗体应具备高亲和力和高效价 。单克
隆抗体尽壁选用具高亲和力的 1gG类,弃 用分泌 1gM类唯抗 的杂交瘤细胞 ;从 腹 水巾制备 中克隆抗体
应提纯免疫球蛋 白。抗 apo(a)单、多克隆抗体应与纤维蛋 白溶酶原 、人 m清中其他蛋 白质和载脂蛋 白无交叉反应 。
42 抗体鉴定
多克隆抗 rlL清的特异性须采用二维电泳或免疫印迹等灵敏 的方法进 行鉴定 ,尽量不采用免疫 电泳
和免疫扩散等灵敏度 、精确度低 的方法 。单克隆抗体的特异性须通过竞争抑制试验进行 分析 ,使 用放射
免疫 、酶联免疫或免疫 印迹 等方法 ;应 保证选用的中抗能够与所有样本 中的各种多态型的 Lp(a)结合 。
抗体应与待测样本 中高 含量的 血浆蛋 白无非特异性反应 。
5 标本的采集 、处理和贮存
5,1 受检者准备
5.2 采血方法
取前臂静脉血。止血带的使用不超过 1min,避免溶血。
5.3 重复采血
因分析和生理因素影响结果 ,可重复测定。应在 1周~8周内对同一受试者采血测试 2次以上 ,取均值。
5.4 样本的处理和贮存
一般采用血清或血浆测定。血清样品采取后在室温静置 30min~45min令其 自行凝固,3h内离
心分离血清。血浆测定结果高于血清。样品宜尽快检测 ,如 当 日不能完成 ,在 4℃ 保存不超过 4d,
-⒛ ℃下可保存 6个月 ,-70℃ 保存时间更久。避免反复冻、融。长期冰冻可引起 Lp(a)测定结果升高。
6 测定方法
Lp(a)的免疫化学定量方法包括 :
a) 凝胶分析 :单 向免疫扩散 、电泳免疫测定
b) 液相分析 :免疫透射比浊测定 免疫散射比浊测定乳胶凝集免疫透射 比浊法
c) 固相分析 :酶联免疫吸附测定 、放射免疫测定、荧光免疫测定。
目前国内临床实验室常用的方法主要为免疫透射比浊法 ,IFCC Lp(a)测定标准化计划采用 ELISA为参考方法。
6.1 免疫透射比浊测定
6.1.1 原理
待测标本中 Lp(a)与试剂中特异性抗体相结合 ,形 成抗原抗体复合物 ,使 反应液中浊度增加 ,透射
光被吸收的量与免疫复合物量呈正相关 ,而复合物量与抗原和抗体的量亦呈函数关系。通过 Lp(a)校
准血清所作的剂量-效应曲线计算待测标本中 Lp(a)含量。
6.1.2 仪器
免疫透射比浊法须用波长 340nm滤光片分光光度计 。检测大批样品宜用全 自动或半 自动生化分
析仪。使用手工操作的光度计或半 自动分析仪 ,还应配备高精密度的稀释器及加样器。光度计吸光值
读数在 1.0时 ,不精密度 (Cη 小于 1%。
6.1.3 试剂的配制
6.1.3.1 样品稀释液 (R1)
一般为 pH7。4~8.0的磷酸盐或 Tris~HCl缓冲液 ,含 聚 乙二醇-6000、 表面活性剂 和 NaN3,
340nm处吸光度应<0.03,4℃ 可存放 1年 。
6.1.3.2 抗血清应用液(R2)
apo(a)抗血清 ,部分或全部 R1成分 ,可添加蛋白质或氨基酸作为稳定剂 ,试剂应无色透明 ,3准0nm
处吸光度应(0。 03,4℃ 可存放 1年 。
6,1.4 参考物质
包括校准物和质控物。
按 IFCC Lp(a)测定标准化的量值传递方案对校准物和质控物进行赋值 ,使其准确性可溯源至国际参考物质。
6.1.5 操作步骤
6.1.5.1 手工操作
免疫比浊手工测定 Lp(a)必须采用双试剂法 ,除去血清 (浆 )样 品及试剂 R1、 R2空 白读数。不同批
号试剂测定必须做校准曲线 ,以 50mg/L~800mg/L浓度范围内 4点~6点为宜。样品用量根据不同
的抗体和测定条件 ,样品与反应总体积比为 1:30~1:5o,波长 340nm,20℃以上反应 zO min。
6.1.5.2 自动化分析
采用双试剂、双波长 (如 340nm/600nm)、二点法进行 自动化分析 ,根据反应进程确定读点时间 ,一
般为 8min~10min。样品与反应液总体积 比为 1:⒛~l:40,剂量-效应 曲线 同手工法 ,用 非线性
Logido巫P(5P)或样条函数拟合曲线计算结果。
6.1.6 技术指标
6.1.6.1 精密度
批内 CV:自 动化分析仪(4%,手工法(8%,试剂空白吸光度(0.05。
6.1.6.2 灵敏度
Lp(a)浓度在 200mg/L时吸光度值读数位于 0。 04~0.07。
6.1.6.3 特异性
抗体应仅与待测样本中 Lp(a)和游离 apo(a)发生特异性反应 ,而与待测样本中其他血浆蛋白无非特异性反应。
6.1.6.4 检测范围
检测范围 :Lp(a)下限≤20mg/L、上限≥800mg/L,Lp(a)浓度为 1zOO mg/L时不发生抗原过剩现象。
6.1.6.5 抗干扰能力
胆红素水平≤⒛O mg/L、血红蛋白≤5000mg/L和甘油三酯≤6mm。l/L的样本对测定结果无影
响。严重脂浊标本对测定有干扰。乳糜血症的样本可将血清放置冰箱过夜或高速离心吸出液面奶油样
层后再行测定。
6.2 酶联免疫吸附测定
大多采用单克隆或多克隆抗 apo(a)建立的双抗体夹心法 ;亦可采用抗 ap°(a)和抗 apoB为捕获和
检测抗体建立的 EusA法,抗 ap°B抗体与纤溶酶原无交叉反应 ,可 有效地排除纤维蛋白溶酶原干扰。
本法的关键技术是保证酶标记抗体稳定 ;分析变异主要由高倍稀释样本引起。本法灵敏度高、特异
性好 ,高 血脂、胆红素等无干扰 ,可 手工操作或 自动化分析。
7 参考方法
采用 FCC Lp(a)测定标准化计划所确定的参考方法。分别采用单克隆抗体 ⒊6(识别 Kongle Ⅳ-2)
和 扯40(识别 K⒒ngle Ⅳ-9)为 包被、检测抗体建立 的 ELISA法 。由于每一个 Lp(a)分子仅含一个
Kringle Ⅳ-9拷 贝 ,本法不受 apo(a)多态性的影响。
8 参考物质
8.1 一级校准物的制备
由两个独立的国际参考实验室分别从同一份新鲜血清中提取 Lp(a)纯品 ,该血清中 apo(a)表型为
单一区带 ,KⅡngle Ⅳ-2的 拷 贝数 为 19;分 别采用超速离心和各 自的层析技术 (赖 氨酸-琼 脂糖或
Sephacryl S4o0)分离、纯化 Lp(a)。提纯的 Lp(a)经氨基酸分析进行定量 ,Lp(a)绝对质量用摩尔单位
表示 ;该参考物质的反应性与新鲜血清或血浆中 Lp(a)具平行性。
8.2 二级校准物的制备
用 Lp(a)一级校准物作标准 ,经参考方法对二级校准物 SRM2B(冻 干人血清 ,含 蔗糖 、赖氨酸和
NaN3等,KⅡngle Ⅳ乇 拷贝数 以 16、 17和 18为 主)进行赋值 ,为 107nmol/L。⒛04年 SRM2B被
IFCC正式接受为 Lp(a)的国际参考物质 ,即 二级校准物。
8.3 制造商工作校准物和产品校准物的制备
按与 WHO/IFCC apoA1、B测定标准化相同的量值传递方案对制造商工作校准物、产品校准物进
行赋值 ,使其准确性可溯源至国际参考物质。
9 参考范围
人群中血清 (浆 )Lp(a)水平呈偏态分布 ,个体差异极大 ,健康人群含量范围为 :O mg/L~1000mg/L。
高 Lp(a)已确认为动脉粥样硬化性心血管疾病的独立危险因素。一般将 Lp(a)参考值定为 300mg/L
以下。基于标准化的 Lp(a)参考值有待确定。
10 建议
Apo(a)有多种多态性 .其分子大小的不均一性对免疫化学测定 Lp(a)的结果有着不同程度的影
响。由于参考物质与待测样本中 apo(a)的大小、分布不可能完全一致 ,即 使采用国际参考物质亦不能
避免测定结果的不准确性 ,从而高估或低估 Lp(a)值。另外,apo(a)分子大小的不均一性对不同测量程
序的测定结果影响程度不同 ,即 抗体对不同分子大小的 ap°(a)反应性和亲和性间的差别 ,导 致不同测
量程序间结果的可比性出现差异。因......
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