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| 标准编号 | GB 15193.15-2015 (GB15193.15-2015) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 生殖毒性试验 | | 英文名称 | National food safety standard -- Genotoxicity test | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 7.1 | | 字数估计 | 10,169 | | 发布日期 | 2015-08-07 | | 实施日期 | 2015-10-07 | | 旧标准 (被替代) | GB 15193.15-2003 | | 标准依据 | 食品安全国家标准的公告2015年第6号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | | 范围 | 本标准规定了生殖毒性试验的试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的生殖毒性作用。 | GB 15193.15-2015: 食品安全国家标准 生殖毒性试验
GB 15193.15-2015 英文名称: National food safety standard -- Genotoxicity test
1 范围
本标准规定了生殖毒性试验的试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的生殖毒性作用。
2 术语和定义
2.1 生殖毒性
对雄性和雌性生殖功能或能力的损害和对后代的有害影响。生殖毒性既可发生于妊娠期,也可发
生于妊前期和哺乳期。表现为外源化学物对生殖过程的影响,例如生殖器官及内分泌系统的变化,对性
周期和性行为的影响,以及对生育力和妊娠结局的影响等。
2.2 发育毒性
个体在出生前暴露于受试物、发育成为成体之前(包括胚期、胎期以及出生后)出现的有害作用,表
现为发育生物体的结构异常、生长改变、功能缺陷和死亡。
2.3 母体毒性
受试物引起亲代雌性妊娠动物直接或间接的健康损害效应,表现为增重减少、功能异常、中毒体征,
甚至死亡。
3 试验目的和原理
凡受试物能引起生殖机能障碍,干扰配子的形成或使生殖细胞受损,其结果除可影响受精卵及其着
床而导致不孕外,尚可影响胚胎的发生及发育,如胚胎死亡导致自然流产、胎仔发育迟缓以及胎仔畸形。
如果对母体造成不良影响会出现妊娠、分娩和乳汁分泌的异常,也可出现胎仔出生后发育异常。
4 试验方法
4.1 受试物
受试物应使用原始样品,若不能使用原始样品,应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理。将
受试物掺入饲料、饮用水或灌胃给予。
4.2 实验动物
实验动物的选择应符合国家标准和有关规定。首选大鼠,选用7周龄~9周龄,试验开始时动物体
重的差异应不超过平均体重的±20%。试验前动物在实验动物房应至少进行3d~5d环境适应和检
疫观察。每组应有足够的雌鼠和雄鼠配对,产生约20只受孕雌鼠。为此,一般在试验开始时两种性别
每组各需要亲代(F0 代)大鼠30只;在继续的试验中用来交配的各代大鼠[子一代(F1 代)、子二代(F2
代)以及子三代(F3 代)]每种性别每组需要25只(至少每窝雌雄各取1只,最多每窝雌雄各取2只)。
选用的F0 代雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。
4.3 剂量及分组
动物按体重随机分组,试验为至少设三个受试物组和一个对照组。应考虑受试物特性(如生物代谢
和生物蓄积特性)的影响作用。如果受试物使用溶媒,对照组应给予溶媒的最大使用量。如果受试物引
起动物食物摄入量和利用率的下降时,那么对照组动物需要与试验组动物配对喂饲。某些受试物的高
剂量受试物组设计应考虑其对营养素平衡的影响,对于非营养成分受试物剂量不应超过饲料的5%。
在受试物理化和生物特性允许的条件下,最高剂量应使F0 代动物出现明显的毒性反应,但不引起
动物死亡;中间剂量可引起轻微的毒性反应;低剂量应不引起亲代及其子代动物的任何毒性反应(可按
最大未观察到有害作用剂量的1/30,或人体推荐摄入量的10倍)。
4.4 实验动物处理
4.4.1 受试物的给予
4.4.1.1 试验期间,所有动物应采用相同的方式给予受试物;每日在同一时间段给予受试物,每周7d。
受试物应在交配前连续给予两种性别的各代大鼠至少10周,并继续给予受试物至试验结束,其中子代
的雌鼠和雄鼠在断乳后每日给予。各代大鼠给予的受试物剂量(按动物体重给予,mg/kg体重或g/kg
体重)、饲料和饮水相同。
4.4.1.2 根据受试物的特性或试验目的,选择合适的给予方式。首选掺入饲料,若受试物加入饲料或饮
水中影响动物的适口性,则应选择灌胃给予受试物。
4.4.1.3 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中,首选溶媒为水,不溶于水的受试物
可使用植物油(如橄榄油、玉米油等),不溶于水或油的受试物可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应新鲜配制,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。应每日在同一时间灌胃1次,每周称体重2次,根据体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重,如为水溶液
时,最大灌胃体积可达20mL/kg体重;如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体重;各组灌胃体
积一致。
4.4.1.4 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳
定性和均一性,以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则,受试物掺入饲料比例一般小于质量分数
的5%,若超过5%时(最大不应超过10%),可调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成
分,且添加比例大于5%时,对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量),使其与剂量组饲料
营养素水平保持一致,同时增设未处理对照组;也可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组饲料营
养素水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫
克(或克)数,即 mg/kg体重(或g/kg体重),当受试物掺入饲料其剂量单位也可表示为 mg/kg(或
g/kg)饲料,掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺入饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物
每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料)。
4.4.2 交配
每次交配时,每只雌鼠应与从同一受试物组随机选择的单个雄鼠同笼(1∶1交配),直到检测到阴
栓,或者经过3个发情期或2周。查到阴栓后应将雌、雄鼠分开,如果经过3个发情期或2周还未进行
交配也应将雌雄鼠分开,不再继续同笼。配对同笼的雌雄鼠应作标记。所有雌鼠在交配期应每天检查
精子或阴栓,直到证明已交配为止。查到阴栓的当天为受孕0d。预计已受孕的雌鼠应分开放入繁殖笼
中,孕鼠临产时应提供筑巢的垫料。
4.4.3 每窝仔鼠数量的标准化
将每窝仔鼠于出生后第4天调整至相同数量(每窝8只~10只),尽量做到每窝内雌、雄数量相等,
也可以窝内雌、雄数量不等,但各窝之间两性别的鼠数应分别相同。原窝中多余的鼠应随机取出,而不
应按体重选择。
4.4.4 观察代数
观察代数随受检目的而异,可作一代、二代、三代或多代观察。如果在两代生殖试验中观察到受试
物对子代有明显的生殖、形态或毒性作用,则需要进行第三代生殖毒性试验,进一步观察受试物的生殖
毒性作用。
4.5 一代、二代和三代生殖毒性试验法
4.5.1 一代生殖毒性试验法
一代生殖毒性试验示意图见图1。
4.5.2 两代生殖毒性试验法
4.5.2.1 两代生殖毒性试验示意图见图2。
图2 两代生殖毒性试验示意图
4.5.2.2 F0 代断乳后,给予受试物3个月,雌-雄即可交配,所产仔鼠为F1a。F1a断乳后不再给予受试
物,观察3个月。
4.5.2.3 F1a断乳后10d将F0 再次交配,所产仔鼠为F1b,将20只孕鼠(F0)中5只产前2d~3d剖腹检
查胎鼠有无畸形;另5只自然分娩观察产后仔鼠情况;作10只孕鼠自然分娩,所产F1b继续繁殖。
4.5.2.4 F1b断乳后,给予含受试物饲料3个月,进行交配,所产F2a在断乳后喂不含受试物的饲料,观察
3个月。
4.5.2.5 F2a断乳后10d将F1b再次交配,产F2b前将F1b孕鼠分两群,每群10只,同4.5.2.3。
4.5.3 三代生殖毒性试验法
三代生殖毒性试验法示意图见图3。
图3 三代生殖毒性试验示意图
4.5.4 亲代、一代、二代、三代繁殖试验
4.5.4.1 亲代、一代、二代、三代繁殖试验可参考4.5.2.2、4.5.2.3进行。
4.5.4.2 根据情况可繁殖两窝以上。
5 观察指标
5.1 对实验动物做全面的临床检查,记录一般健康状况、受试物的所有的毒性和功效作用所产生的症
状、相关的行为改变、分娩困难或延迟的迹象、所有的毒性体征及死亡率,通过每日检查(F0,F1代雌鼠)阴道和子宫颈,以及雌鼠的发情周期有无异常。
5.2 F0、F1 代和F2 代动物在给予受试物的第1天称重,以后每周称重2次,母鼠应在受孕的第0天、第
7天、第14天和第21天称重,在哺乳期应同时称仔鼠的窝重。
5.3 在交配前及受孕期,记录每周摄食量,如经饮水给予受试物,还应记录每周饮水量。
5.4 试验结束时,根据试验设计,各代雄鼠均应对附睾的精子进行检查,对精子的形状、数量以及活动
能力进行评价。精子的活动能力和精子形态,可只检查对照组和高剂量受试物组的各代雄鼠,每只动物
至少检查200个精子。
5.5 在分娩后(哺乳0d)应尽快检查记录每窝仔鼠的数量、性别、死......
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