标准搜索结果: 'GB 5009.240-2016'
| 标准编号 | GB 5009.240-2016 (GB5009.240-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中伏马毒素的测定 | | 英文名称 | Inspection of grain and oils -- Determination of fumonisin in corn and its products by high liquid chromatography and fluorometer with immunoaffinity column cleanup | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X10 | | 字数估计 | 42,461 | | 发布日期 | 2016-08-31 | | 实施日期 | 2017-03-01 | | 旧标准 (被替代) | SN/T 1958-2007; SN/T 1572-2005; GB/T 25228-2010 | | 标准依据 | 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第11号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | GB 5009.240-2016
(Food safety national standard - Determination of fumonisin in foods)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中伏马毒素的测定
2016-08-31发布
2017-03-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
前言
本标准代替GB/T 25228-2010《粮油检验 玉米及其制品中伏马毒素含量测定 免疫亲和柱净
化高效液相色谱法和荧光光度法》、SN/T 1958-2007《进出口食品中伏马毒素B1 残留量检测方法 酶
联免疫吸附法》、SN/T 1572-2005《进出口粮谷中伏马毒素检验方法 高效液相色谱法》。
本标准将以上标准进行了整合,主要修订如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定”;
---伏马毒素种类增加为伏马毒素B1、B2、B3 三种;
---增加了免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法作为第一法;
---增加了高效液相色谱-串联质谱联用法作为第二法;
---取消荧光光度法;
---改变了样品提取溶液;
---改变了免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法流动相的组成。
食品安全国家标准
食品中伏马毒素的测定
1 范围
本标准规定了玉米及其制品中伏马毒素B1、伏马毒素B2、伏马毒素B3(以下简写为FB1、FB2、FB3)
的测定方法。
本标准第一法为免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法,第二法为高效液相色谱-串联质谱联
用法,第三法为免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱法,适用于玉米及其制品中伏马毒素的测定。
第一法 免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法
2 原理
样品用乙腈-水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱净化,去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干
扰物质。经高效液相色谱分离后柱后邻苯二甲醛衍生,荧光检测,外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.3 乙酸(CH3COOH)。
3.1.4 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.5 氯化钠(NaCl)。
3.1.6 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
3.1.7 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.8 氯化钾(KCl)。
3.1.9 硼砂(Na2B4O7·10H2O)。
3.1.10 2-巯基乙醇(C2H6OS)。
3.1.11 邻苯二甲醛(OPA,C8H6O2)。
3.1.12 吐温-20(C58H114O26)。
3.2 溶液配制
3.2.1 甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,加入到999mL水中,混合均匀。
3.2.2 乙腈-水溶液(50+50):分别量取500mL乙腈和500mL水,混合均匀。
3.2.3 乙腈-水溶液(20+80):分别量取200mL乙腈和800mL水,混合均匀。
3.2.4 甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均匀。
3.2.5 氢氧化钠溶液(1mol/L):准确称取氢氧化钠4.0g,溶于100mL水,混合均匀。
3.2.6 磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用
980mL水溶解,用盐酸调整pH至7.4,用水稀释至1000mL,混合均匀。
3.2.7 吐温-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐温-20,加入磷酸盐缓冲液(3.2.6)并稀释至1000mL,
混合均匀。
3.2.8 硼砂溶液(0.05mol/L,pH10.5):称取硼砂19.1g,溶于980mL水中,用氢氧化钠溶液调pH至
10.5,用水稀释至1000mL,混合均匀。
3.2.9 衍生溶液:称取2.0g邻苯二甲醛,溶于20mL甲醇中,用硼砂溶液(0.05mol/L,pH10.5)(3.2.8)稀
释至500mL,加入2-巯基乙醇500μL,混匀,装入棕色瓶中,现用现配。
3.3 标准品
3.3.1 伏马毒素B1(FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。
3.3.2 伏马毒素B2(FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
3.3.3 伏马毒素B3(FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3 各0.01g(精确至0.0001g)至小烧杯
中,用乙腈-水溶液(3.2.2)溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光-20℃保
存。有效期6个月。
3.4.2 混合标准溶液:准确吸取FB1 标准储备液1mL、FB2 和FB3 标准储备液0.5mL至同一10mL
容量瓶中,加乙腈-水溶液(3.2.2)稀释至刻度,得到FB1 浓度为10μg/mL、FB2 和FB3 浓度为5μg/mL
的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1 浓度为1μg/mL、FB2 和FB3 浓度为0.5μg/mL的混合标准
溶液。此溶液密封后避光4℃保存,有效期6个月。
3.4.3 混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(3.2.3)稀释,配制成FB1 浓度依次
为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL,FB2 和FB3 浓度依次为
10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL的系列混合标准工作溶液。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪,带荧光检测器。
4.2 柱后衍生系统。
4.3 天平:感量0.01g和0.0001g。
4.4 均质器。
4.5 振荡器。
4.6 氮吹仪。
4.7 离心机:转速≥4000r/min。
4.8 免疫亲和柱(柱容量≥5000ng,FB1 柱回收率≥80%)(柱容量及柱回收率验证方法参见附录B)。
注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。
4.9 微孔滤膜:0.45μm,有机型。
5 分析步骤
5.1 样品制备
将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm,混匀分成2份作
为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。
玉米油样品直接取2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。
在制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
5.2 试样提取
准确称取固体样品5g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中,加入20mL乙腈-水溶液(3.2.2),
涡旋或振荡提取20min,取出后,在4000r/min下离心5min,将上清液转移至另一离心管中。
玉米油样品操作同固体样品,提取液在下层。
5.3 试样净化
取2mL提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液(3.2.7),混合均匀后过免疫亲和柱,流速控制在
1mL/min~3mL/min,用10mLPBS缓冲液淋洗免疫亲和柱,分别用1mL甲醇-乙酸溶液(3.2.4)洗
脱免疫亲和柱三次,收集洗脱液,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(3.2.3)溶解残渣。涡旋
30s,过0.45μm微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。
注:由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同,实际操作时,请参照厂商提供的操作说明和程序使用。
5.4 仪器参考条件
色谱柱:C18色谱柱:250mm×4.6mm,5μm,或相当者。
检测波长:激发波长335nm;发射波长440nm。
流动相:A:甲酸水溶液(3.2.1);B:甲醇。梯度洗脱,洗脱程序见表1。
流动相流速:0.8mL/min。
衍生液流速:0.4mL/min。
柱温:40℃。
反应器温度:40℃。
进样量:50μL。
表1 流动相洗脱程序
时间
min
流动相A
流动相B
0.00 45.0 55.0
2.00 45.0 55.0
9.00 30.0 70.0
14.00 10.0 90.0
14.50 10.0 90.0
15.00 45.0 55.0
22.00 45.0 55.0
5.5 试样溶液的测定
在5.4项色谱条件下,将50.0μL系列伏马毒素混合标准工作溶液(3.4.3)按浓度从低到高依次注
入高效液相色谱仪;待仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x 轴),目标物质的峰面积为纵坐
标(y轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(1)计算:
y=ax+b (1)
式中:
y---目标物质的峰面积比;
a---回归曲线的斜率;
x---目标物质的浓度;
b ---回归曲线的截距。
标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果样品含量超过标准曲线
范围,需稀释后再测定。
5.6 空白试验
不称取试样,按5.2和5.3的步骤做空白实验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
6 分析结果的表述
待测样品中FB1、FB2、FB3 的含量按式(2)计算:
X=
ci×V×f
(2)
式中:
X ---待测样品中FB1、FB2、FB3 的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
ci ---待测物进样液中FB1、FB2、FB3 的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V ---定容体积,单位为毫升(mL);
f ---试液稀释倍数;
m ---样品的称样量,单位为克(g)。
注:计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留两位有效数字。
7 精密度
样品中伏马毒素含量在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值
的20%。
8 其他
当称样量为5g时,FB1、FB2、FB3 的检出限分别为17μg/kg、8μg/kg、8μg/kg;定量限分别为
50μg/kg、25μg/kg、25μg/kg。
第二法 高效液相色谱-串联质谱联用法
9 原理
样品加入同位素内标,乙腈-水溶液提取,经稀释后过免疫亲和柱或强阴离子交换固相萃取柱净化,
去除脂肪、蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质。净化液中的伏马毒素经过高效液相色谱分离,串联
质谱检测,同位素内标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
10.1.3 乙酸(CH3COOH)。
10.1.4 氯化钠(NaCl)。
10.1.5 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
10.1.6 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
10.1.7 氯化钾(KCl)。
10.1.8 吐温-20(C58H114O26)。
10.2 溶液配制
10.2.1 甲酸水溶液(0.1%):吸取1mL甲酸,加入到999mL水中,混合均匀。
10.2.2 乙腈-甲醇溶液(50+50):分别量取500mL甲醇和500mL乙腈,混合均匀。
10.2.3 乙腈-水溶液(50+50):分别量取500mL乙腈和500mL水,混合均匀。
10.2.4 乙腈-水溶液(20+80):分别量取200mL乙腈和800mL水,混合均匀。
10.2.5 甲醇-水溶液(60+20):分别量取600mL甲醇和200mL水,混合均匀。
10.2.6 甲醇-乙酸溶液(99+1):吸取1mL乙酸,加入到99mL甲醇中,混合均匀。
10.2.7 甲醇-乙酸溶液(98+2):吸取2mL乙酸,加入到98mL甲醇中,混合均匀。
10.2.8 磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用
980mL水溶解,用盐酸调整pH至7.4,用水稀释至1000mL,混合均匀。
10.2.9 吐温-20/PBS溶液(0.1%):吸取1mL吐温-20,加入磷酸盐缓冲液(10.2.8)并稀释至1000mL,混
合均匀。
10.3 标准品
10.3.1 FB1、FB2、FB3 标准品
伏马毒素B1(FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。
伏马毒素B2(FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
伏马毒素B3(FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
10.3.2 13C34-伏马毒素B1、B2、B3 同位素内标
13C34-伏马毒素B1(13C34-FB1,C34H59NO15),纯度≥95%,或有证标准溶液。
13C34-伏马毒素B2(13C34-FB2,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
13C34-伏马毒素B3(13C34-FB3,C34H59NO14),纯度≥95%,或有证标准溶液。
注:在检测中可以只使用13C34-FB1 一种同位素内标,但需要对被测定试样基质进行加标实验,评估和确定13C34-FB1
与其他被测伏马毒素的基质效应。或使用基质匹配校正曲线。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 标准储备溶液(0.1mg/mL):分别准确称取FB1、FB2、FB3 各0.01g(精确至0.0001g)至小烧
杯中,用乙腈-水溶液(10.2.3)溶解,并转移至100mL容量瓶中,定容至刻度。此溶液密封后避光
-20℃ 保存。有效期6个月。
10.4.2 混合标准溶液:准确吸取FB1 标准储备液1mL、FB2 和FB3 标准储备液0.5mL至同一10mL
容量瓶中,加乙腈-水溶液(10.2.3)稀释至刻度,得到FB1 浓度为10μg/mL、FB2 和FB3 浓度分别为
5μg/mL的混合标准溶液。再稀释10倍,得到FB1 浓度为1μg/mL、FB2 和FB3 浓度分别为0.5μg/mL
的混合标准溶液。此溶液密封后避光4℃保存。有效期6个月。
10.4.3 混合同位素标准溶液:准确吸取13C34-FB1(25μg/mL)、13C34-FB2(10μg/mL)、13C34-FB3
(10μg/mL)各1mL至同一10mL容量瓶中,加乙腈-水溶液(10.2.3)稀释至刻度,得到含13C34-FB1
2.5μg/mL、13C34-FB2 和13C34-FB31μg/mL的混合同位素标准溶液。再稀释10倍,得到含13C34-FB1
250ng/mL、13C34-FB2 和13C34-FB3100ng/mL的混合同位素标准工作溶液。有效期6个月。
10.4.4 混合标准工作溶液:准确吸取混合标准溶液,用乙腈-水溶液(10.2.4)稀释,加入混合同位素标
准工作溶液(10.4.3),配制成FB1 浓度依次为20ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、
400ng/mL,FB2和FB3浓度依次为10ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL
的系列混合标准工作溶液,每个标准工作溶液中含有13C34-FB125ng/mL、13C34-FB2 和13C34-FB3
10ng/mL。
11 仪器和设备
11.1 高效液相色谱-串联质谱联用仪:配有电喷雾离子源。
11.2 天平:感量0.01g和0.0001g。
11.3 均质器。
11.4 振荡器。
11.5 氮吹仪。
11.6 离心机:转速≥4000r/min。
11.7 强阴离子交换固相萃取柱(硅胶基,6mL,500mg)。
11.8 免疫亲和柱(柱容量≥5000ng,FB1柱回收率≥80%)。(柱容量及柱回收率验证方法参见附录B)
注:对于每个批次的亲和柱在使用前需进行质量检验。
11.9 微孔滤膜:0.22μm,有机型。
12 分析步骤
12.1 样品制备
将固体样品按四分法缩分至1kg,全部用谷物粉碎机磨碎并细至粒度小于1mm,混匀分成2份作
为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。
玉米油样品直接取2份作为试样,分别装入洁净的容器内,密封,标识后置于4℃下避光保存。
在制样的操作过程中,应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
12.2 试样提取
准确称取固体样品5g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中,加入混合同位素标准工作溶液
(10.4.3)400μL,加入20mL乙腈-水溶液(10.2.3),涡旋或振荡提取20min,取出后,在4000r/min下
离心5min,将上清液转移至另一离心管中。
玉米油样品操作同固体样品,提取液在下层。
12.3 试样净化
12.3.1 免疫亲和柱净化
取2mL提取液,加入47mL吐温-20/PBS溶液(10.2.9),混合均匀后过免疫亲和柱,流速控制在
1mL/min~3mL/min,用10mLPBS缓冲液(10.2.8)淋洗免疫亲和柱,分别用1mL甲醇-乙酸溶液
(10.2.7)洗脱免疫亲和柱三次,收集洗脱液,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(10.2.4)溶解残
渣。涡旋30s,过0.22μm微孔滤膜后,收集于进样瓶中,待测。
注:由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同,实际操作时,请参照厂商提供的操作说明和程序使用。
12.3.2 强阴离子交换固相萃取柱净化
取3mL提取液,加入8mL甲醇-水溶液(10.2.5),混合均匀后过强阴离子交换固相萃取柱(使用前
按要求活化),分别用8mL甲醇-水溶液(10.2.5)和3mL甲醇淋洗,用10mL甲醇-乙酸溶液(10.2.6)洗
脱,55℃下氮吹至干,加入1mL乙腈-水溶液(10.2.4)溶解残渣。涡旋30s,过0.22μm微孔滤膜后,收
集于进样瓶中,待测。
12.4 仪器参考条件
12.4.1 液相色谱条件
色谱柱:C18柱,100mm×2.1mm,1.7μm,或相当者。
流动相:A:甲酸水溶液(0.1%);B:乙腈-甲醇溶液(50+50)。梯度洗脱,梯度见表2。
流速:0.35mL/min。
柱温:30℃。
进样量:10μL。
表2 流动相梯度洗脱程序
时间
min
流动相A
流动相B
0.00 70.0 30.0
2.30 30.0 70.0
4.00 30.0 70.0
4.20 0 100
4.80 0 100
5.00 70.0 30.0
12.4.2 质谱参数
离子化模式:电喷雾电离正离子模式(ESI+)。
质谱扫描方式:多反应监测(MRM)。
监测离子对信息见表3,其他仪器参考条件见附录C。
表3 质谱参数
毒素名称 母离子
定量
子离子
碰撞能量
eV
定性
子离子
碰撞能量
eV
FB1 722 352 25 334 35
FB2 706 336 35 354 30
FB3 706 336 35 354 30
13C34-FB1 756 374 35 356 40
13C34-FB2 740 358 35 376 30
13C34-FB3 740 358 35 376 30
12.5 定性判定
用高效液相色谱-串联质谱联用法对样品进行定性判定,在相同试验条件下,样品中应呈现定量离
子对和定性离子对的色谱峰,被测物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保
留时间一致;样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比
的偏差不超过表4规定范围,则可以判断样品中存在对应的目标物质。
表4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度(k) k≥50% 50% >k≥20% 20% >k≥10% k≤10%
......
|