路径: 主页 > GB > 第141页 > GB 15193.20-2014 | 标准编号 | GB 15193.20-2014 (GB15193.20-2014) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞TK基因突变试验 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- TK gene mutation test | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 07.100 | | 字数估计 | 9,952 | | 发布日期 | 12/24/2014 | | 实施日期 | 5/1/2015 | | 旧标准 (被替代) | GB 15193.20-2003 | | 标准依据 | 卫计委公告2014年第21号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | | 范围 | 本标准规定了体外哺乳类胸苷激酶(thymidine kinase, TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。本标准适用于评价受试物的致突变作用。 | GB 15193.20-2014: 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞TK基因突变试验
GB 15193.20-2014 英文名称: National Food Safety Standard -- TK gene mutation test
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞TK基因突变试验
1 范围
本标准规定了体外哺乳类胸苷激酶(thymidinekinase,TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。
本标准适用于评价受试物的致突变作用。
2 术语和定义
2.1 TK基因
哺乳类动物的胸苷激酶基因。人类的 TK基因定位于17号染色体长臂远端;小鼠的则定位于
11号染色体。
2.2 突变频率
在某种细胞系中,某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的比例(单位通常为10-6)。
3 试验目的和原理
TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。
TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷生成胸苷酸的反应。在正常情况
下,此反应并非生命所必需,原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸,即由胸苷酸
合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸苷类似
,则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸,进而掺入DNA,造成致死
性突变,故细胞不能存活。若TK基因发生突变,导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化,亦不能掺入
DNA,故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长,即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数,
可计算突变频率,从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同
的集落,即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞),有研究表明,大集落/正常
生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起,而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸
变,或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。
4 仪器和试剂
4.1 仪器
实验室常用设备、低温冰箱(-80℃)或液氮罐、生物安全柜、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机。
4.2 培养基
4.3 代谢活化系统
4.3.1 S9辅助因子
4.3.1.1 镁钾溶液
4.3.1.3 辅酶-Ⅱ(氧化型)溶液
无菌条件下称取辅酶-Ⅱ,用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液。现用现配。
4.3.1.4 葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
称取葡萄糖-6-磷酸钠盐,用蒸馏水溶解配制成0.05mol/L,过滤灭菌。现用现配。
4.3.2 大鼠肝S9组分的制备
选健康雄性成年SD或 Wistar大鼠,体重150g~200g左右,约5周龄~6周龄。采用苯巴比妥钠
和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备,经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘黄酮,剂量均为80mg/kg
体重,连续3d,禁食16h后断头处死动物,处死前禁食12h。
处死动物后取出肝脏,称重后用新鲜冰冷的氯化钾溶液(0.15mol/L)连续冲洗肝脏数次,以便除去
能抑制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝(湿重)加氯化钾溶液(0.1mol/L)3mL,连同烧杯移入冰浴
中,用消毒剪刀剪碎肝脏,在玻璃匀浆器(低于4000r/min,1min~2min)或组织匀浆器(低于
20000r/min,1min)中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
将制成的肝匀浆在低温(0℃~4℃)高速离心机上以9000g离心10min,吸出上清液为S9组分,
分装于无菌冷冻管中,每管2mL左右,用液氮或干冰速冻后置-80℃低温保存。
S9组分制成后,经无菌检查,测定蛋白含量(Lowry法),每毫升蛋白含量不超过40mg为宜,并经
间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-80℃低温或冰冻干燥,保存期不超过1年。
4.3.3 10%S9混合液
一般由S9组分和辅助因子按1∶9组成10%的S9混合液,无菌,现用现配
或过滤除菌。10%S9混合液10mL配制如下:
4.5 三氟胸苷的配制
取TFT30mg,用PBS溶解加至10mL,配成3mg/mL的储备液。
应用时按1‰的体积比加入培养基。
5 试验方法
5.1 细胞和培养条件
tk+/-基因型的L5178Y-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞或TK6人类淋巴母细胞。
两种细胞均在5%二氧化碳、37℃、饱和湿度条件下作常规悬浮培养。
为避免在培养和传代期间自发突变的细胞对试验结果的影响,在正式试验前,应清除自发突变的
tk-/-基因型细胞。方法是:
a) 对于L5178Y细胞,使用THMG培养基处理24h,以800r/min~1000r/min的速度离心
4min~6min、洗涤后在不含氨甲喋呤的THG培养基中培养2d;
b) 对于TK6细胞,使用CHAT培养基处理48h,以800r/min~1000r/min的速度离心4min~
6min、洗涤后在不含氨基喋呤的CHT培养基中继续培养3d。
5.2 受试物
5.2.1 受试物的配制
受试物在使用前应现用现配,否则须证实在特定贮存条件下不影响其稳定性。
5.2.2 受试物剂量设定
至少应设置3个~4个可供分析的浓度。对于有细胞毒性的受试物,应根据细胞毒性预试验结果,
在RS或RSG为20%~80%范围内设3个~4个剂量(浓度)水平,同时应该考虑受试物对溶解度、pH
和摩尔渗透压浓度的影响。方法是:取生长良好的细胞,调整密度为5×105/mL,按1%体积加入不同
浓度受试物,37℃震摇处理3h(L5178Y细胞)或4h(TK6细胞),细胞经离心洗涤后,作2d(L5178Y
细胞)或3d(TK6细胞)表达培养,每天计数细胞密度并计算相对悬浮生长(RSG)。或取上述处理后细
胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/孔),每个剂量种
1块~2块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数每块平
板有集落生长的孔数,计算相对存活率(RS)。
对于细胞毒性极低的受试物,最高浓度应设为5mg/mL、5μL/mL或0.01mol/L。对于相对不溶
解的物质,其最高浓度的设置应达到不影响细胞培养的最大可加入浓度。
5.2.3 对照的设定
一般情况下,每一项试验中,在代谢活化系统存在和不存在的条件下均应设阳性和阴性(溶媒)对照组。
5.3 处理
取生长良好的细胞,调整密度为5×105/mL,按1%体积加入受试物(需代谢活化的情况下,同时加
入终浓度为1%~10%的S9混合物),37 ℃振摇处理3h(L5178Y 细胞)或4h(TK6细胞),以
800r/min~1000r/min的速度离心4min~6min,弃上清液,用PBS或不含血清的培养基洗涤细胞
2遍,重新悬浮细胞于含10%马血清的RPMI1640培养液中,并调整细胞密度为2×105/mL。
5.4 PE0(0d的平板接种效率)测定
取适量细胞悬液,作梯度稀释至8个细胞/mL,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均1.6个细胞/
孔),每个剂量种1块~2块平板,37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,
计数每块平板有集落生长的孔数。
5.5 表达
取5.3所得细胞悬液,作2d(L5178Y细胞)或3d(TK6细胞)表达培养,每天计数细胞密度并保持
密度在106/mL以下,计算相对悬浮生长(RSG)。
5.6 PE2(L5178Y细胞)或PE3(TK6细胞)测定
表达培养结束后,取适量细胞悬液,按5.4方法测定PE2/PE3。
5.7 突变频率(MF)测定
5.7.1 L5178Y细胞
L5178Y细胞表达培养2d后,取适量细胞悬液,调整细胞密度为1×104/mL,加入TFT(终浓度为
3μg/mL),混匀,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均2000个细胞/孔),每个剂量作2块~4块板,
37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数有突变集落生长的孔数。突变集落按大集落
(LC:直径≥1/4孔径,密度低)和小集落(,SC:直径<1/4孔径,密度高)分
别计数。极小集落可再继续培养3d后计数。
5.7.2 TK6细胞
TK6细胞表达培养3d后,取适量细胞悬液,调整细胞密度至1.5×105/mL,加入TFT(终浓度为
3μg/mL),混匀,接种96孔板(每孔加0.2mL,即平均30000个细胞/孔),每个剂量作2块~4块板,
37℃,5%二氧化碳,饱和湿度条件下培养12d,计数正常生长突变集落()。
然后每孔再追加适量TFT,继续培养12d,计数新长成的缓慢生长突变集落。
6 数据处理与结果评价
6.1 数据处理
6.1.1 平板效率(PE0、PE2/PE3)
平板效率(%)的计算见式(1):
6.2 结果评价
6.2.1 试验成立的条件
试验所用L5178Y细胞的自发突变频率应在50×10-6~200×10-6之间;TK6细胞的自发突变频
率应在1.5×10-6~5.5×10-6之间,同时自发突变频率应在本实验室历史记录范围内。阴性/溶媒对照
的PE0 在60%~140%之间,PE2/PE3 的值在70%~130%之间。阳性对照的T-MF与阴性/溶媒对照
有显著差异,或是阴性/溶媒对照3倍以上。
6.2.2 受试物阳性和阴性结果的判定
6.2.2.1 阳性结果的判定。受试物一个以上剂量(浓度)组的T-MF显著高于阴性/溶媒对照,或是阴
性/溶媒对照的3倍以上,并有剂量-反应趋势,则可判定为阳性。但如仅在相对存活率低于20%的高剂
量情况下出现阳性,则结果判为“可疑”。
6.2.2.2 阴性结果的判定。在相对存活率低于20%的情况下未见突变频率的增加,可判定为阴性。
7 试验报告
7.1 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。
7.2 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。
7.3 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。
7.4 试验摘要。
7.5 受试物:名称、鉴定资料、CAS编号(如已知)、纯度、与本试
验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。
7.6 溶媒和载体:溶媒或载体的选择依据,受试物在溶媒和载体中的溶解性和稳定性。
7.7 细胞系:名称、来源及其特性。
7.8 试验条件:溶媒、剂量、代谢活化系统、阳性对照物、操作步骤等。
7.9 试验结果:每个剂量(浓度)表达培养期间细胞的密度、0d的平板接种效率、第2天或第3天的平
板接种效率、相对存活率、相对悬浮生长和相对总生长、总突变频率[必要......
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