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| 标准编号 | GB 31656.14-2022 (GB31656.14-2022) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 水产品中27种性激素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 | | 英文名称 | (National Food Safety Standards Determination of 27 Sex Hormone Residues in Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry) | | 行业 | 国家标准 | | 字数估计 | 12,157 | | 发布日期 | 2022-09-20 | | 实施日期 | 2023-02-01 | GB 31656.14-2022: 食品安全国家标准 水产品中27种性激素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
GB 31656.14-2022 英文名称: (National Food Safety Standards Determination of 27 Sex Hormone Residues in Aquatic Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry)
中华人民共和国国家卫生健康委员会
食品安全国家标准
水产品中27种性激素残留量的测定
液相色谱-串联质谱法
中华人民共和国国家标准
发 布
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
中华人民共和国农业农村部
前 言
本文件按照 GB/T １１-２０２０«标准化工作导则 第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定
起草.
本文件系首次发布.
食品安全国家标准
水产品中２７种性激素残留量的测定 液相色谱Ｇ串联质谱法
１ 范围
本文件规定了水产品中２７种性激素残留量检测的制样和液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.
本文件适用于鱼、虾和蟹可食部分中己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、
苯甲酸雌二醇、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙
酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左
炔诺孕酮残留量的测定.
２ 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅
该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
GB/T ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T ３０８９１-２０１４ 水产品抽样规范
３ 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
４ 原理
试样中残留的性激素用乙酸乙酯Ｇ甲基叔丁基醚混合溶剂和乙酸乙酯依次提取,提取液经浓缩、C１８固
相萃取柱净化,用液相色谱Ｇ串联质谱仪测定,内标法定量.
５ 试剂与材料
以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯;水为符合GB/T ６６８２规定的一级水.
５１ 试剂
５１１ 甲醇(CH３OH):色谱纯.
５１２ 正己烷(C６H１４):色谱纯.
５１３ 甲基叔丁基醚(C５H１２O):色谱纯.
５１４ 乙酸乙酯(C４H８O２):色谱纯.
５１５ 冰乙酸(CH３COOH).
５１６ 三水乙酸钠(C２H３NaO２３H２O).
５１７ 氨水(NH３H２O).
５２ 溶液配制
５２１ 乙酸Ｇ乙酸钠缓冲溶液:取三水乙酸钠２１５g、冰乙酸２６mL,加水适量使溶解并稀释至５００mL,
混匀.
５２２ ００２％氨水:取氨水１００μL于５００mL水中,混匀.临用前配制.
５２３ 乙酸乙酯Ｇ甲基叔丁基醚溶液:取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等体积混合.
５３ 标准品
５３１ 性激素:己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、
GB ３１６５６１４-２０２２
诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基
孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮:含量≥９７％,
具体见附录A.
５３２ 内标:己烯雌酚ＧD８、雌酮ＧD２、雌二醇Ｇ１３C２、甲基睾酮ＧD３、孕酮ＧD９、左炔诺孕酮ＧD６和甲羟孕酮ＧD３:
含量≥９７％,具体见附录A.
５４ 标准溶液制备
５４１ 标准储备液:取性激素类标准品各１０mg,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于１００mL棕
色容量瓶,配制成浓度均为１００μg/mL的标准储备液.-１８℃以下保存,有效期１年.
５４２ 混合标准中间液:准确量取各标准储备液适量,于１００mL棕色容量瓶,用甲醇稀释配制成己二
烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、
孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为
１μg/mL;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为２μg/mL;雌三醇和
炔雌醇浓度均为４μg/mL的混合标准中间液.-１８℃以下保存,有效期６个月.
５４３ 混合标准工作液:准确量取混合标准中间液１０mL,于５０mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,
配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸
诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟
孕酮浓度均为０２μg/mL;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为
０４μg/mL;雌三醇和炔雌醇浓度均为０８μg/mL的混合标准工作液.-１８℃以下保存,有效期３
个月.
５４４ 内标标准储备液:取同位素内标物各１０mg,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于５０mL
棕色容量瓶,配制成浓度为２００μg/mL的内标单标储备溶液.-１８℃以下保存,有效期１年.
５４５ 混合内标工作液:分别准确量取内标储备液适量,于１００mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,
配制成雌二醇Ｇ１３C２ 浓度为２μg/mL;己烯雌酚ＧD８、雌酮ＧD２、甲基睾酮ＧD３、孕酮ＧD９、甲羟孕酮ＧD３ 和左炔
诺孕酮ＧD６ 浓度均为１μg/mL的混合内标工作液.-１８℃以下保存,有效期６个月.
５５ 材料
５５１ C１８固相萃取柱:５００mg/３mL,或相当者.
５５２ 微孔尼龙滤膜:０２２μm.
６ 仪器和设备
６１ 高效液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源(ESI).
６２ 分析天平:感量０００００１g和００１g.
６３ 高速离心机:１００００r/min.
６４ 涡旋混合器.
６５ 均质机.
６６ 旋转蒸发仪.
６７ 固相萃取装置.
６８ 梨形瓶:１００mL.
６９ 超声波清洗器.
６１０ 塑料离心管:１０mL和５０mL.
７ 试样的制备与保存
７１ 试样的制备
按GB/T ３０８９１-２０１４附录B的要求制样.
a) 取均质的供试样品,作为供试试样;
b) 取均质的空白样品,作为空白试样;
c) 取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.
７２ 试样的保存
-１８℃以下保存.
８ 测定步骤
８１ 提取
取试料５g(准确至±００５g),于５０mL离心管中,准确加入３０μL混合内标工作液和乙酸Ｇ乙酸钠缓
冲液１０mL,涡旋３０s,加乙酸乙酯Ｇ甲基叔丁基醚溶液１０mL,涡旋１min,超声１０min,涡旋混合１min,
于８０００r/min离心８min,取上层有机相于１００mL梨形瓶;残渣用乙酸乙酯１０mL重复提取１次,有机
相合并至梨形瓶中,于３５℃水浴旋转蒸发至干.对蒸干后有油脂残留的样品,用氮气或空气将残留在油
脂中的乙酸乙酯吹除干净.加入正己烷７mL溶解残留物,备用.
８２ 净化
取C１８固相萃取柱,依次用甲醇、正己烷各５mL活化.取备用液,过柱,控制流速不超过１滴/s;用正
己烷１０mL淋洗,吹干;用甲醇１０mL洗脱,收集洗脱液,于４０℃水浴旋转蒸发至干.准确加入甲醇
０８５mL,涡旋混合１min,再准确加入水０１５mL,混合３０s,８０００r/min,离心６min,上清液用０２２μm
尼龙滤膜过滤,供液相色谱Ｇ串联质谱测定.
８３ 基质匹配标准工作曲线的制备
分别取１０μL、２５μL、５０μL、１００μL、２５０μL、５００μL混合标准工作溶液于５mL玻璃离心管中,分别
加混合内标工作液３０μL,吹干,加入经７１和７２步骤处理所得的基质空白溶液１０mL,混合１min,配
制成激素浓度为２ng/mL~４００ng/mL系列基质匹配标准工作液,上机测定.以标准物质特征离子色谱
峰的峰面积与内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的浓度为横坐标,绘制基质标准工作曲
线.求回归方程和相关系数.
８４ 测定
８４１ 液相色谱参考条件
a) 色谱柱:XBridgeShieldRP１８柱(４６mm×１５０mm,５μm),或相当者;
b) 流速:０４mL/min;
c) 进样量:２０μL;
d) 柱温:２５℃;
e) 流动相A为甲醇;流动相B为００２％氨水,梯度洗脱程序见表１.
８４２ 质谱参考条件
a) 离子源:ESI;
b) 喷雾电压:３０kV;
c) 离子传输管温度:３５０℃;
GB ３１６５６１４-２０２２
d) 鞘气流速:１３３L/min;
e) 辅助气流速:３３L/min;
f) 碰撞气压:０１９９５Pa;
g) 检测方式:多反应监测(MRM),２７种激素及内标物多反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描
方式见表２.
８５ 测定法
８５１ 定性测定
在同样的测试条件下,试料溶液中激素类药物的保留时间与标准工作液中激素类药物的保留时间之
比偏差在±２５％以内;且检测到的离子的相对丰度,应当与浓度相当的校正标准溶液的离子相对丰度一
致.其允许偏差应符合表３的要求.
８５２ 定量测定
取试料溶液和基质匹配标准工作液,作单点或多点校准,按内标法定量.基质匹配标准工作液及试料
溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述色谱Ｇ质谱条件下,标准溶液特征离子质量
色谱图见附录B.
８６ 空白试验
取空白试样,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作.
９ 结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式(１)计算.
１０ 方法灵敏度、准确度和精密度
１０１ 灵敏度
本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸
诺龙、丙酸睾酮、孕酮、２１αＧ羟基孕酮、１７αＧ羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟
孕酮检测限为０５μg/kg,定量限为１０μg/kg;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇......
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