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GB 4789.35-2023

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基本信息
标准编号 GB 4789.35-2023 (GB4789.35-2023)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
英文名称 (National Food Safety Standards Food Microbiology Testing Commercial Sterility Testing)
行业 国家标准
中标分类 X09
字数估计 17,123
发布日期 2023-09-06
实施日期 2024-03-06
发布机构 中华人民共和国国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局
范围 本标准规定了食品商业无菌检验程序、检验步骤、结果判定与报告要求。本标准适用于食品商业无菌的检验。

GB 4789.35-2023: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
GB 4789.35-2023 英文版: National food safety standard - Food microbiological examination - Lactic acid bacteria
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 乳酸菌检验
2023-09-06发布
2024-03-06实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》。
本标准与GB 4789.35-2016相比,主要变化如下:
---增加了实时荧光PCR方法为选做方法;
---修改了乳酸菌的定义、样品制备、培养时间;
---修改了嗜热链球菌和乳杆菌计数方法的描述;
---修改了部分培养基成分、储备液浓度和制备方法。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 乳酸菌检验
1 范围
本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lacticacidbacteria)的检验方法。
本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。
2 术语和定义
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
3.2 厌氧培养装置:厌氧培养箱、厌氧罐、厌氧袋或能提供同等厌氧效果的装置。
3.3 冰箱:2℃~8℃。
3.4 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。
3.5 涡旋混匀仪。
3.6 电子天平:感量0.001g。
3.7 实时定量PCR仪。
3.8 恒温水浴锅或金属浴。
3.9 离心机:离心力>10000×g。
3.10 无菌试管:18mm×180mm、15mm×100mm。
3.11 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
3.12 微量移液器和灭菌吸头:2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。
3.13 无菌锥形瓶:500mL、250mL。
3.14 无菌平皿:直径90mm。
3.15 PCR管。
4 培养基和试剂
4.1 稀释液:见附录A中A.1。
4.2 MRS(ManRogosaSharpe)琼脂培养基:见附录A中A.2。
4.3 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)和半胱氨酸盐酸盐(CysteineHydrochloride)改良 MRS琼脂培养
基:见附录A中A.3。
4.4 MC(ModifiedChalmers)琼脂培养基:见附录A中A.4。
4.5 0.5%蔗糖发酵管:见附录A中A.5。
4.6 0.5%纤维二糖发酵管:见附录A中A.5。
4.7 0.5%麦芽糖发酵管:见附录A中A.5。
4.8 0.5%甘露醇发酵管:见附录A中A.5。
4.9 0.5%水杨苷发酵管:见附录A中A.5。
4.10 0.5%山梨醇发酵管:见附录A中A.5。
4.11 0.5%乳糖发酵管:见附录A中A.5。
4.12 七叶苷发酵管:见附录A中A.6。
4.13 革兰氏染色液:见附录A中A.7。
4.14 生理盐水:见附录A中A.8。
4.15 DNA提取液:见附录A中A.9。
4.16 10×PCR缓冲液:见附录A中A.10。
4.17 莫匹罗星锂盐(C26H43O9·Li):化学纯。
4.18 半胱氨酸盐酸盐(C3H8ClNO2S):纯度>99%。
4.19 dNTPs。
4.20 TaqDNA聚合酶:5U/μL。
4.21 七种乳酸菌引物探针。
4.22 灭菌去离子水。
5 检验程序
6 操作步骤
6.1 样品制备
6.1.1 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
6.1.2 稀释液在试验前应在36℃±1℃条件下充分预热15min~30min。
6.1.3 冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45℃的条件
下解冻,时间不超过15min。
6.1.4 固体和半固体样品:以无菌操作称取25g样品,置于装有225mL稀释液的无菌均质杯内,于
8000×g~10000×g均质1min~2min,制成1∶10样品匀液;或置于225mL稀释液的无菌均质袋
中,用拍击式均质器拍打1min~2min制成1∶10的样品匀液。
6.1.5 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL稀释液
的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或均质袋中,充分振摇或拍击式均质器拍打1min~
2min,制成1∶10的样品匀液。
6.1.6 经特殊技术(如包埋技术)处理的含乳酸菌食品样品应在相应技术/工艺要求下进行有效前
处理。
6.2 稀释及培养
6.2.1 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液
的无菌试管中(注意吸管或微量移液器吸头尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复
吹打使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
6.2.2 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一
次,即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
6.2.3 经特殊技术(如包埋技术)处理的含乳酸菌食品应按照相应技术/工艺要求进行稀释。
6.3 乳酸菌计数
6.3.1 乳酸菌总数
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1。
6.3.2 双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL
样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃~50℃的莫匹罗
星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良 MRS琼脂培养基倾注入平皿15mL~20mL,转动平皿使混合均匀。培
养基凝固后倒置于36℃±1℃厌氧培养,根据双歧杆菌生长特性,一般选择培养48h,若菌落无生长或
生长较小可选择培养至72h,培养后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板倾注要求在15min
内完成。
6.3.3 嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取
1mL样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃~50℃的
MC琼脂培养基及时倾注入平皿15mL~20mL,转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃±
1℃有氧培养,根据嗜热链球菌生长特性,一般选择培养48h,若菌落无生长或生长较小可选择培养至
72h。嗜热链球菌在 MC琼脂培养基平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,
直径2mm±1mm,菌落背面为粉红色。
6.3.4 乳杆菌计数
根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1mL样品匀
液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。稀释液移入平皿后,将冷却至48℃~50℃的 MRS琼脂培
养基倾注入平皿15mL~20mL,转动平皿使混合均匀。培养基凝固后倒置于36℃±1℃厌氧培养,根
据乳杆菌生长特性,一般选择培养48h,若菌落无生长或生长较小可选择培养至72h。从样品稀释到
平板倾注要求在15min内完成。
6.4 菌落计数
见GB 4789.2菌落计数部分。
6.5 结果的表述
见GB 4789.2计算方法部分。
6.6 菌落数的报告
见GB 4789.2菌落总数的报告部分。
7 结果与报告
根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。
8 乳酸菌的鉴定(可选做)
8.1 第一法 生化鉴定
8.1.1 纯培养
挑取3个或以上单菌落,嗜热链球菌接种于 MC琼脂平板,置36℃±1℃有氧培养48h,乳杆菌属
接种于 MRS琼脂平板,置36℃±1℃厌氧培养48h。
8.1.2 双歧杆菌的鉴定
按GB 4789.34的规定操作。
8.1.3 涂片镜检
嗜热链球菌菌体镜下呈球形或球杆状,直径为0.5μm~2.0μm,成对或成链排列,无芽孢,革兰氏
染色阳性。乳杆菌属镜下菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状,无芽孢,革兰氏染色阳性。
8.1.4 乳酸菌菌种主要生化反应
乳酸菌菌种主要生化反应见表2和表3。
8.2 第二法 实时荧光PCR法鉴定
8.2.1 纯培养
同8.1.1。
8.2.2 DNA模板制备
使用接种环刮取 MC琼脂平板或 MRS琼脂平板上的菌落2个~10个,悬浮于200μL灭菌生理盐
水中,充分混匀,10000×g~12000×g离心3min,弃去上清。加入50μLDNA提取液涡旋混匀,置
于100℃水浴或者金属浴中10min后迅速冷却,10000×g~12000×g离心3min。吸取上清液至新
的PCR反应管内,作为DNA模板使用。提取后的DNA模板应置于4℃供当天使用,否则应于-20℃以
下保存,并于1周内使用。
注:根据实验室实际情况,也可用商品化试剂盒制备DNA模板。
8.2.3 PCR反应体系
总反应体系体积为25μL:10× PCR缓冲液2.5μL、上下游引物(10μmol/L)各1μL、探针
(10μmol/L)0.5μL、dNTPs(2.5μmol/L)3μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、模板DNA1μL、
灭菌去离子水补足至25μL。每个反应均应设置至少2个平行。
注:反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。亦可选用含有PCR缓冲液、
MgCl2、dNTP和Taq酶等成分基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液。
8.2.4 PCR反应条件
50℃5min,95℃预变性3min,94℃变性5s、60℃退火延伸40s(同时收集FAM 荧光),进行
40个循环。 ......
   
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