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GB 5009.154-2016 English:
GB 5009.154-2016 GB 5009.154-2016: 食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定
GB 5009.154-2016 英文名称: National food safety standard -- Determination of vitamin B6 in foods
1 范围
本标准规定了食品中维生素B6 的测定方法。
本标准第一法为高效液相色谱法,适用于添加了维生素B6 的食品测定;第二法为微生物法,适用于
各类食品中维生素B6 的测定。
第一法 高效液相色谱法
2 原理
试样经提取等前处理后,经C18色谱柱分离,高效液相色谱-荧光检测器检测,外标法定量测定维生
素B6(吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺)的含量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 辛烷磺酸钠(C8H17NaO3S)。
3.1.2 冰乙酸(C2H4O2)。
3.1.3 三乙胺(C6H15N):色谱纯。
3.1.4 甲醇(CH4O):色谱纯。
3.1.5 盐酸(HCl)。
3.1.6 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.7 淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
3.2 试剂配制
3.2.1 盐酸溶液(5.0mol/L):量取45mL盐酸,用水稀释并定容至100mL。
3.2.2 盐酸溶液(0.1mol/L):吸取9mL盐酸,用水稀释并定容至1000mL。
3.2.3 氢氧化钠溶液(5.0mol/L):称取20g氢氧化钠,加50mL水溶解,冷却后,用水定容至100mL。
3.2.4 氢氧化钠溶液(0.1mol/L):称取0.4g氢氧化钠,加50mL水溶解,冷却后,用水定容至
100mL。
3.3 标准品
3.3.1 盐酸吡哆醇(C8H12ClNO3,CAS号:58-56-0):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书
的标准物质。
3.3.2 盐酸吡哆醛(C8H10ClNO3,CAS号:65-22-5):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质证书
的标准物质。
3.3.3 双盐酸吡哆胺(C8H14Cl2N2O3,CAS号:524-36-7):纯度≥99%,或经国家认证并授予标准物质
证书的标准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 吡哆醇标准储备液(1mg/mL):准确称取60.8mg盐酸吡哆醇标准品,用0.1mol/L盐酸溶液溶
解后定容到50mL,在-20℃下避光保存,有效期1个月。
3.4.2 吡哆醛标准储备液(1mg/mL):准确称取60.9mg盐酸吡哆醛标准品,用0.1mol/L盐酸溶液溶
解后定容到50mL,在-20℃下避光保存,有效期1个月。
3.4.3 吡哆胺标准储备液(1mg/mL):准确称取71.7mg双盐酸吡哆胺标准品,用0.1mol/L盐酸溶液
溶解后定容到50mL,在-20℃下避光保存,有效期1个月。
3.4.4 维生素B6 混合标准中间液(20μg/mL):分别准确吸取吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的标准储备液各
1.00mL,用0.1mol/L盐酸溶液稀释并定容至50mL。临用前配制。
3.4.5 维生素B6 混合标准系列工作液:分别准确吸取维生素B6 混合标准中间液0.5mL、1.0mL、
2.0mL、3.0mL、5.0mL,至100mL容量瓶中,用水定容。该标准系列浓度分别为0.10μg/mL、
0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL。临用前配制。
注:标准储备液在使用前需要进行浓度校正,校正方法参照附录A。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪:带荧光检测器。
4.2 天平:感量1mg和0.01mg。
4.3 pH计:精度0.01。
4.4 涡旋混合器。
4.5 超声波振荡器。
4.6 分光光度计。
4.7 恒温培养箱,或性能相当者。
5 分析步骤
5.1 试样制备
5.1.1 含淀粉的试样
a) 固体试样:称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.01g),于150mL锥形瓶中,加入约25
mL45℃~50℃的水,混匀。加入约0.5g淀粉酶,混匀后向锥形瓶中充氮,盖上瓶塞,置50
℃~60℃培养箱内约30min。取出冷却至室温。
b) 液体试样:称取混合均匀的液体试样约20g(精确至0.01g)于150mL锥形瓶中,混匀。加入
约0.5g淀粉酶,混匀后向锥形瓶中充氮,盖上瓶塞,置50℃~60℃培养箱内约30min。取出
冷却至室温。
5.1.2 不含淀粉的试样
a) 固体试样:称取混合均匀的固体试样约5g(精确至0.01g),于150mL锥形瓶中,加入约25
mL45℃~50℃的水,混匀。静置5min~10min,冷却至室温。
b) 液体试样:称取混合均匀的液体试样约20g(精确至0.01g)于150mL锥形瓶中。静置5min
~10min。
5.1.3 待测液的制备
用盐酸溶液,调节上述试样溶液的pH至1.7±0.1,放置约1min。再用氢氧化钠溶液调节试样溶
液的pH至4.5±0.1。把上述锥形瓶放入超声波振荡器中,超声振荡约10min。将试样溶液转移至
50mL容量瓶中,用水冲洗锥形瓶。洗液合并于50mL容量瓶中,用水定容至50mL。另取50mL锥
形瓶,上面放入漏斗和滤纸,把定容后的试样溶液倒入其中,自然过滤。滤液再经0.45μm微孔滤膜过
滤,用试管收集,转移1mL滤液至进样瓶作为试样待测液。
注:操作过程应避免强光照射。
5.2 仪器参考条件
仪器参考条件列出如下:
a) 色谱柱:C18柱,柱长150mm,柱内径4.6mm,柱填料粒径5μm,或相当者;
b) 流动相:甲醇50mL、辛烷磺酸钠2.0g、三乙胺2.5mL,用水溶解并定容到1000mL后,用冰
乙酸调pH至3.0±0.1,过0.45μm微孔滤膜过滤;
c) 流速:1mL/min;
d) 柱温:30℃;
e) 检测波长:激发波长293nm,发射波长395nm;
f) 进样体积:10μL。
5.3 标准曲线的制作
将维生素B6 混合标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中,测定各组分的峰面积,以相应标准
工作液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
5.4 试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到各组分相应的峰面积,根据标准曲线得到待测试样溶液中
维生素B6 各组分的浓度。
6 分析结果的表述
试样中维生素B6 各组分的含量按式(1)计算。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
8 其他
当取样量为5.00g时,方法检出限为:吡哆醇0.02mg/100g,吡哆醛0.02mg/100g,吡哆胺
0.02mg/100g;方法定量限为:吡哆醇0.05mg/100g,吡哆醛0.05mg/100g,吡哆胺0.05mg/100g。
第二法 微生物法
9 原理
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