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| 标准编号 | GB 5009.82-2016 (GB5009.82-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定 | | 英文名称 | Determination of retinol and tocopherol in foods | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 24,276 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 5413.9-2010; GB/T 5009.82-2003; GB/T 9695.26-2008; GB/T 9695.30-2008; NY/T 1598-2008 | | 标准依据 | 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号 | GB 5009.82-2016: 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定
GB 5009.82-2016 英文名称: Determination of retinol and tocopherol in foods
中华人民共和国国家标准
1 范围
本标准规定了食品中维生素A、维生素E和维生素D的测定方法。
本标准第一法适用于食品中维生素A和维生素E的测定。
本标准第二法适用于食用油、坚果、豆类和辣椒粉等食物中维生素E的测定。
本标准第三法适用于食品中维生素D2 和维生素D3 的测定。
本标准第四法适用于配方食品中维生素D2 或维生素D3 的测定。
第一法 食品中维生素A和维生素E的测定 反相高效液相色谱法
5 分析步骤
5.1 试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。
5.2 试样处理
警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫
外光照,尽可能避光操作;提取过程应在通风柜中操作。
5.2.1 皂化
5.2.1.1 不含淀粉样品
称取2g~5g(精确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体试样于150mL
平底烧瓶中,固体试样需加入约20mL温水,混匀,再加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30
mL无水乙醇,加入10mL~20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴震荡皂化30
min,皂化后立即用冷水冷却至室温。
注:皂化时间一般为30min,如皂化液冷却后,液面有浮油,需要加入适量氢氧化钾溶液,并适当延长皂化时间。
5.2.1.2 含淀粉样品
称取2g~5g(精确至0.01g)经均质处理的固体试样或50g(精确至0.01g)液体样品于150mL
平底烧瓶中,固体试样需用约20mL温水混匀,加入0.5g~1g淀粉酶,放入60℃水浴避光恒温振荡
30min后,取出,向酶解液中加入1.0g抗坏血酸和0.1gBHT,混匀,加入30mL无水乙醇,10mL~
20mL氢氧化钾溶液,边加边振摇,混匀后于80℃恒温水浴振荡皂化30min,皂化后立即用冷水冷却至室温。
5.2.2 提取
将皂化液用30mL水转入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚-乙醚混合液,振荡萃取
5min,将下层溶液转移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的混合醚液再次萃取,合并醚层。
注:如只测维生素A与α-生育酚,可用石油醚作提取剂。
5.2.3 洗涤
用约100mL水洗涤醚层,约需重复3次,直至将醚层洗至中性(可用pH 试纸检测下层溶液pH值),去除下层水相。
5.2.4 浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠(约3g)滤入250mL旋转蒸发瓶或氮气浓缩管中,用约15mL石油
醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次,并入蒸发瓶内,并将其接在旋转蒸发仪或气体浓缩仪上,于40℃水
浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚液剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹至近干。用甲醇分
次将蒸发瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高
效液相色谱测定。
5.3 色谱参考条件
色谱参考条件列出如下:
a) 色谱柱:C30柱(柱长250mm,内径4.6mm,粒径3μm),或相当者;
b) 柱温:20℃;
c) 流动相:A:水;B:甲醇,洗脱梯度见表1;
d) 流速:0.8mL/min;
e) 紫外检测波长:维生素A为325nm;维生素E为294nm;
f) 进样量:10μL;
g) 标准色谱图和样品色谱图见C.1。
注1:如难以将柱温控制在20℃±2℃,可改用PFP柱分离异构体,流动相为水和甲醇梯度洗脱。
注2:如样品中只含α-生育酚,不需分离β-生育酚和γ-生育酚,可选用C18柱,流动相为甲醇。
注3:如有荧光检测器,可选用荧光检测器检测,对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性,可按以下检测波长检
测:维生素A激发波长328nm,发射波长440nm;维生素E激发波长294nm,发射波长328nm。
7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 其他当取样量为5g,定容10mL时,维生素A的紫外检出限为10μg/100g,定量限为30μg/100g;生
育酚的紫外检出限为40μg/100g,定量限为120μg/100g。
第二法 食品中维生素E的测定 正相高效液相色谱法
9 原理
试样中的维生素E经有机溶剂提取、浓缩后,用高效液相色谱酰氨基柱或硅胶柱分离,经荧光检测
器检测,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 无水乙醇(C2H5OH):色谱纯,经检验不含醛类物质,检查方法参见A.1。
10.1.2 乙醚[(CH3CH2)2O]:分析纯,经检验不含氧化物,检查方法参见A.2。
10.1.3 石油醚(C5H12O2):沸程为30℃~60℃。
10.1.4 无水硫酸钠(Na2SO4)。
10.1.5 正己烷(n-C6H14):色谱纯。
10.1.6 异丙醇 [(CH3)2CHOH]:色谱纯。
10.1.7 叔丁基甲基醚 [CH3OC(CH3)3]:色谱纯。
10.1.8 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.9 四氢呋喃(C4H8O):色谱纯。
10.1.10 1,4-二氧六环(C4H8O2):色谱纯。
10.1.11 2,6-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT。
10.1.12 有机系过滤头(孔径为0.22μm)。
10.2 试剂配制
10.2.1 石油醚-乙醚溶液(1+1):量取200mL石油醚,加入200mL乙醚,混匀,临用前配制。
10.2.2 流动相:正己烷+[叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液(20+1+0.1)]=90+10,临用前配制。
10.3 标准品
10.3.1 α-生育酚(C29H50O2,CAS号:10191-41-0):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;
10.3.2 β-生育酚(C28H4802,CAS号:148-03-8):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;
10.3.3 γ-生育酚(C28H4802,CAS号:54-28-4):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质;
10.3.4 δ-生育酚(C27H4602,CAS号:119-13-1):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 维生素E标准储备溶液(1.00mg/mL):分别称取4种生育酚异构体标准品各50.0mg(准确至
0.1mg),用无水乙醇溶解于50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液浓度约为1.00mg/mL。将溶液转移
至棕色试剂瓶中,密封后,在-20℃下避光保存,有效期6个月。临用前将溶液回温至20℃,并进行浓
度校正(校正方法参见附录B)。
10.4.2 维生素E标准溶液中间液:准确吸取维生素E标准储备溶液各1.00mL于同一100mL容量
瓶中,用氮气吹除乙醇后,用流动相定容至刻度,此溶液中维生素E各生育酚浓度为10.00μg/mL。密
封后,在-20℃下避光保存,有效期半个月。
10.4.3 维生素E标准系列工作溶液:分别准确吸取维生素E混合标准溶液中间液0.20mL、0.50mL、
1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中,用流动相定容至刻度,该标准系列中4
种生育酚浓度分别为0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL。
11 仪器和设备
11.1 分析天平:感量为0.1mg。
11.2 恒温水浴振荡器。
11.3 旋转蒸发仪。
11.4 氮吹仪。
11.5 紫外分光光度计。
11.6 索氏脂肪抽提仪或加速溶剂萃取仪。
11.7 高效液相色谱仪,带荧光检测器或紫外检测器。
12 分析步骤
12.1 试样制备
将一定数量的样品按要求经过缩分、粉碎、均质后,储存于样品瓶中,避光冷藏,尽快测定。
12.2 试样处理
警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物质;分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;处理过程应避免紫外光照,尽可能避光操作。
12.2.1 植物油脂
称取0.5g~2g油样(准确至0.01g)于25mL的棕色容量瓶中,加入0.1gBHT,加入10mL流动
相超声或涡旋振荡溶解后,用流动相定容至刻度,摇匀。过孔径为0.22μm有机系滤头于棕色进样瓶中,待进样。
12.2.2 奶油、黄油
称取2g~5g样品(准确至0.01g)于50mL的离心管中,加入0.1gBHT,45℃水浴融化,加入
5g无水硫酸钠,涡旋1min,混匀,加入25mL流动相超声或涡旋振荡提取,离心,将上清液转移至浓缩
瓶中,再用20mL流动相重复提取1次,合并上清液至浓缩瓶,在旋转蒸发器或气体浓缩仪上,于45℃
水浴中减压蒸馏或气流浓缩,待瓶中醚剩下约2mL时,取下蒸发瓶,立即用氮气吹干。用流动相将浓
缩瓶中残留物溶解并转移至10mL容量瓶中,定容至刻度,摇匀。溶液过0.22μm有机系滤膜后供高效液相色谱测定。
12.2.3 坚果、豆类、辣椒粉等干基植物样品
称取2g~5g样品(准确至0.01g),用索氏提取仪或加速溶剂萃取仪提取其中的植物油脂,将含油
脂的提取溶剂转移至250mL蒸发瓶内,于40℃水浴中减压蒸馏或气流浓缩至干,取下蒸发瓶,用
10mL流动相将油脂转移至25mL容量瓶中,加入0.1gBHT,超声或涡旋振荡溶解后,用流动相定容
至刻度,摇匀。过孔径为0.22μm有机系滤头于棕色进样瓶中,待进样。
12.3 色谱参考条件
色谱参考条件列出如下:
a) 色谱柱:酰氨基柱(柱长150mm,内径3.0mm,粒径1.7μm)或相当者;
b) 柱温:30℃;
c) 流动相:正己烷+[叔丁基甲基醚-四氢呋喃-甲醇混合液(20+1+0.1)]=90+10;
d) 流速:0.8mL/min;
e) 荧光检测波长:激发波长294nm,发射波长328nm;
f) 进样量:10μL。
注:可用Si60硅胶柱(柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm)分离4种生育酚异构体,推荐流动相为正己烷与1,4-
二氧六环按(95+5)的比例混合。
12.4 标准曲线的制作
本法采用外标法定量。将维生素E标准系列工作溶液从低浓度到高浓度分别注入高效液相色谱
仪中,测定相应的峰面积。以峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。
12.5 样品测定
试样液经高效液相色谱仪分析,测得峰面积,采用外标法通过上述标准曲线计算其浓度。在测定过
程中,建议每测定10个样品用同一份标准溶液或标准物质检查仪器的稳定性。
14 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15 其他当取样量为2g,定容25mL时,各生育酚的检出限为50μg/100g,定量限为150μg/100g。
第三法 食品中维生素D的测定 液相色谱-串联质谱法
16 原理试样中加入维生素D2 和维生素D3 的同位素内标后,经氢氧化钾乙醇溶液皂化(含淀粉试样先用
淀粉酶酶解)、提取、硅胶固相萃取柱净化、浓缩后,反相高效液相色谱C18柱分离,串联质谱法检测,内标法定量。
17 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯。水为GB/T 6682规定的一级水。
17.1 试剂
17.1.1 无水乙醇(C2H5OH):色谱纯,经检验不含醛类物质,检查方法参见A.1。
17.1.2 抗坏血酸 (C6H8O6)。
17.1.3 2,6-二叔丁基对甲酚(C15H24O):简称BHT。
17.1.4 淀粉酶:活力单位≥100U/mg。
17.1.5 氢氧化钾(KOH)。
17.1.6 乙酸乙酯(C4H8O2):色谱纯。
17.1.7 正己烷(n-C6H14):色谱纯。
17.1.8 无水硫酸钠(Na2SO4)。
17.1.9 pH 试纸(pH范围1~14)。
17.1.10 固相萃取柱(硅胶):6mL,500mg。
17.1.11 甲醇(CH3OH):色谱纯。
17.1.12 甲酸(HCOOH):色谱纯。
17.1.13 甲酸铵(HCOONH4):色谱纯。
17.2 试剂配制
17.2.1 氢氧化钾溶液(50g/100g):50g氢氧化钾,加入50mL水溶解,冷却后储存于聚乙烯瓶中。
17.2.2 乙酸乙酯-正己烷溶液(5+95):量取5mL乙酸乙酯加入到95mL正己烷中,混匀。
17.2.3 乙酸乙酯-正己烷溶液(15+85):量取15mL乙酸乙酯加入到85mL正己烷中,混匀。
17.2.4 0.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵溶液:称取0.315g甲酸铵,加入0.5mL甲酸、1000mL水溶解,超声混匀。
17.2.5 0.05%甲酸-5mmol/L甲酸铵甲醇溶液:称取0.315g甲酸铵,加入0.5mL甲酸、1000mL甲醇溶解,超声混匀。
17.3 标准品
17.3.1 维生素D2 标准品:钙化醇(C28H44O,CAS号:50-14-6),纯度 >98%,或经国家认证并授予标准
物质证书的标准物质。
17.3.2 维生素D3 标准品:胆钙化醇(C27H44O,CAS号:511-28-4),纯度 >98%,或经国家认证并授予
标准物质证书的标准物质。
17.3.3 维生素D2-d3 内标溶液(C28H44O-d3):100μg/mL。
17.3.4 维生素D3-d3 内标溶液(C27H44O-d3):100μg/mL。
17.4 标准溶液配制
17.4.1 维生素D2 标准储备溶液:准确称取维生素D2 标准品10.0mg,用色谱纯无水乙醇溶解并定容
至100mL,使其浓度约为100μg/mL,转移至棕色试剂瓶中,于-20℃冰箱中密封保存,有效期3个
月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法见附录B)。
17.4.2 维生素D3 标准储备溶液:准确称取维生素D2 标准品10.0mg,用色谱纯无水乙醇溶解并定容
至10mL,使其浓度约为100μg/mL,转移至100mL的棕色试剂瓶中,于-20℃冰箱中密封保存,有效
期3个月。临用前用紫外分光光度法校正其浓度(校正方法见附录B)。
17.4.3 维生素D2 标准中间使用液:准确吸取维生素D2 标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容
至100mL,浓度约为10.0μg/mL,有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。
17.4.4 维生素D3 标准中间使用液:准确吸取维生素D3 标准储备溶液10.00mL,用流动相稀释并定容
至100mL棕色容量瓶中,浓度约为10.0μg/mL,有效期1个月。准确浓度按校正后的浓度折算。
17.4.5 维生素D2 和维生素D3混合标准使用液:准......
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