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| 标准编号 | GB/T 38480-2020 (GB/T38480-2020) | | 中文名称 | 微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定 菌丝生长速率法 | | 英文名称 | Determination of antifungal activity for microbial secondary metabolites - Mycelial growth rate method | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A21 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 6,624 | | 发布日期 | 2020-11-19 | | 实施日期 | 2020-11-19 | | 起草单位 | 中国计量大学、中国标准化研究院 | | 归口单位 | 中国标准化研究院 | | 标准依据 | 国家标准公告2020年第26号 | | 提出机构 | 中国标准化研究院 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 38480-2020
Determination of antifungal activity for microbial secondary metabolites - Mycelial growth rate method
ICS 07.080
A21
中华人民共和国国家标准
微生物源抗生素类次生代谢产物
抗真菌活性测定 菌丝生长速率法
2020-11-19发布
2020-11-19实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位:中国计量大学、中国标准化研究院。
本标准主要起草人:申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、崔海峰、张雅芬、许益鹏。
微生物源抗生素类次生代谢产物
抗真菌活性测定 菌丝生长速率法
1 范围
本标准规定了用菌丝生长速率法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性的方法。
本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
IC50
对真菌生长的抑制率达到50%时的浓度。
3.2
抗真菌活性 antifungalactivity
抗制真菌生长繁殖的能力。
4 原理
将供试次生代谢产物与培养基混合,以培养基上菌落的生长速度来衡量次生代谢产物抑丝状真菌
的能力,通过计算IC50来判定活性。
5 试剂或材料
除非另有规定,所用试剂均为分析纯。
5.1 水。GB/T 6682一级水。
5.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。称取马铃薯浸粉3.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g,然后将上述
各成分加入1000mL蒸馏水中,煮沸溶解,pH自然,分装至250mL锥形瓶中,121℃灭菌20min,备
用。也可采用市售的商业培养基。
5.3 指示菌标准菌株:立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKühn)ATCC76145。
根据微生物源抗生素类次生代谢产物应用领域不同,也可以采用其他菌株作为供试菌。
6 仪器设备
6.1 恒温培养箱:温度偏差在±1℃以内。
6.2 超净工作台。
6.3 无菌培养皿:直径90mm。
6.4 测量仪:游标卡尺,精度0.1mm。
6.5 无菌打孔器:内径5mm±0.1mm。
6.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器。
7 操作步骤
7.1 指示菌培养
倾注融化并经121℃灭菌冷却至55℃左右的PDA固体培养基15mL于无菌培养皿内,待其凝固
后制成PDA平板,将立枯丝核菌冻存菌株用无菌接种针挑取少量菌丝接种到PDA平板中间,28℃±1℃
恒温培养箱培养至菌丝覆盖整个平板,备用。上述操作均在超净工作台内进行。
7.2 供试样品制备
极性样品直接用水充分溶解(非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解),配制成一定浓度的
母液,经无菌0.45μm滤膜过滤,然后用无菌水(或相应的表面活性剂)按2倍或5倍浓度逐级稀释,制
备成至少5个不同浓度的待测溶液,逐级稀释时应确保既有抑制率大于50%分布的浓度点,也有抑制
率小于50%分布的浓度点,现配现用。
7.3 检测平板制备
将7.2中制备的供试样品分别用冷却至55℃±1℃的PDA培养基按1∶9的比例稀释,充分混匀
后用无菌吸管各取10mL移至无菌培养皿内,轻轻摇动培养皿使其均匀铺平,待其凝固后制成检测平
板,用对应的溶剂和PDA混合制备的平板作为空白对照平板,备用。
7.4 抑菌活性测定
用无菌打孔器(内径5mm±0.1mm)在活化的指示菌平板中相同的半径边缘打孔,用无菌镊子取
菌饼正置于7.3制备的检测平板中间。每个处理重复5次。将平板正置于28℃±1℃恒温培养箱中培
养24h~48h,取出,采用十字交叉法测量菌落直径,两次测量所得的平均值即为菌落直径。
8 结果计算
抑制率按式(1)计算:
I=
(D1-5)-(D2-5)
D1-5 ×
100% (1)
式中:
I ---抑制率;
D1---空白对照平板中形成的菌落直径,单位为毫米(mm);
D2---供试次生代谢产物平板中形成的菌落直径,单位为毫米(mm)。......
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