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| 标准编号 | GB/T 38481-2020 (GB/T38481-2020) | | 中文名称 | 微生物超低频突变测定 双重测序法 | | 英文名称 | Determination of ultralow-frequency mutations for microorganisms - Duplex sequencing | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A21 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 6,617 | | 发布日期 | 2020-11-19 | | 实施日期 | 2020-11-19 | | 起草单位 | 清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、江汉大学、中国标准化研究院 | | 归口单位 | 中国标准化研究院 | | 标准依据 | 国家标准公告2020年第26号 | | 提出机构 | 中国标准化研究院 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 38481-2020
Determination of ultralow-frequency mutations for microorganisms - Duplex sequencing
ICS 07.080
A21
中华人民共和国国家标准
微生物超低频突变测定 双重测序法
2020-11-19发布
2020-11-19实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位:清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、江汉大学、中国标准化研究院。
本标准主要起草人:张翀、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、彭海、马爱进。
微生物超低频突变测定 双重测序法
1 范围
本标准规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法。
本标准适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
超低频突变 ultralow-frequencymutations
化学、物理或生物因素导致微生物DNA发生的频率低于1×10-5的永久性改变。
3.2
条形码标签 barcodelabel
接在待测DNA片段两侧的核苷酸片段,用以标示同一扩增家族的DNA,协助进行突变位点的
确认。
3.3
所有含两端互补条形码标签的DNA片段。
3.4
带有相同条形码标签的双链DNA序列,包含反向互补链。
4 原理
在待测DNA片段两端接上一段12nt随机且互补的双链核苷酸条形码标签,然后对所有带有条形
码标签的序列进行双重的高通量测序。利用12nt随机互补标签,排除掉测序文库制备过程中所引入
的突变,进而准确检测突变位点和突变率。
5 试剂
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
5.1 水。GB/T 6682,一级。
5.2 接头链标签序列:
N为A、T、C或G,由12个随机碱基组成标签片段。
将寡核苷酸溶解于 Tris-EDTA缓冲液(5.8)或纯水中至终浓度100μmol/L,并放置于-20℃
保存。
5.3 接头链扩增引物序列:
X为按样品需求设计的文库标记序列。
将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液(5.8)或纯水中至终浓度20μmol/L,并放置于-20℃保存。
5.4 基因提取试剂盒。
5.5 高通量测序建库试剂盒。
5.6 DNA分选磁珠试剂盒。
5.7 DNA分析试剂盒。
5.8 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液,pH8.0。由10mmol/L的分析纯Tris和
0.1mmol/L的EDTA配制,调整pH值至8.0。
6 仪器设备及器具
6.1 PCR扩增仪。
6.2 磁性分离器。
6.3 高通量测序仪。
6.4 核酸分析系统。
6.5 电子天平:精度为0.01g。
7 样品制备
7.1 DNA提取
利用微生物基因组或质粒提取试剂盒对待测样本进行基因组或质粒DNA提取操作,最后使用
50μL的无菌双蒸水进行DNA洗脱。提取得到的DNA样品使用核酸定量仪检测核酸的浓度和纯度。
7.2 DNA片段化和末端修复
利用高通量基因测序建库试剂盒,将待测样品DNA片段化至100bp~1000bp,将末端修复为
A尾。
8 接头条形码标签的合成
8.1 退火
将浓度100μmol/L的两个接头链寡核苷酸片段各取100μL进行退火,在95℃下加热5min后,
自然降温,并静置1h。
8.2 延伸
将8.1中得到的产物按试剂说明与脱氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPs)和克列诺酶混合均匀,分
装至两个0.2mL的PCR管中并在37℃下孵育1h。
8.3 DNA回收
使用无水乙醇沉淀DNA,并加入200μL纯水溶解。
8.4 酶切
用限制性内切酶HpyCH4Ⅲ对DNA产物进行酶切。将混合物分装至4个0.2mL的PCR管中,
并在37℃孵育16h。
8.5 纯化
加入并均匀混合50μL的3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2),最终体积为550μL。将混合溶液平分到
1.5mL的具塞离心管内,每管275μL,并加入625μL室温的无水乙醇到各管中。充分混匀,并以大于
10000r/min的转速在4℃下离心30min。
移除上清液后,加入1mL的75%(体积分数)乙醇至各管中。充分混匀,并立即以大于10000r/min
的转速在4℃下离心30min。
移除上清液后,在纸巾上倒置试管10min以干燥,接着正置5min。
加入100μL的Tris-EDTA缓冲液至上一步骤产物中并混合均匀。将所有试管集在一起,最终体
积为200μL,终浓度约为50μmol/L,放入-20℃的冰箱中保存。
9 接头条形码标签与待测样本DNA的连接和扩增
9.1 连接
将互补条形码标签与DNA片段化和末端修复产物按总浓度20∶1混合后,利用T4DNA连接酶
连接,在25℃孵育15min。
9.2 分选
利用DNA分选磁珠试剂盒分选得到的产物,获得长度为200bp~900bp的DNA片段,并以DNA
试剂盒定量DNA浓度。
9.3 PCR扩增
以分选产物为模板,接头链扩增引物序列为引物,按每20万读数数据量取1amolDNA样量进行
PCR扩增,扩增程序根据所选用高保真DNA聚合酶的要求设定。
10 高通量测序
利用高通量测序试剂盒对扩增得到的PCR产物进行高通量测序,每个待测样品测序碱基数量设置
为大于或等于10Gb。
11 结果分析
对高通量测序数据进行清理,然后按下列程序进行数据分析:
a) 根据随机标签进行互补标签分类,每一个家族需包含双向互补序列。互补标签家族大小分布
在排除1之后,最大峰值分布应于6~1......
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