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| 标准编号 | GB/T 38483-2020 (GB/T38483-2020) | | 中文名称 | 微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定 抑菌圈法 | | 英文名称 | Determination of antibacterial activity for microbial secondary metabolites - Inhibition zone method | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A21 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 6,652 | | 发布日期 | 2020-11-19 | | 实施日期 | 2020-11-19 | | 起草单位 | 中国计量大学、中国标准化研究院 | | 归口单位 | 中国标准化研究院 | | 标准依据 | 国家标准公告2020年第26号 | | 提出机构 | 中国标准化研究院 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 38483-2020
ICS 07.080
A21
中华人民共和国国家标准
微生物源抗生素类次生代谢产物
抗细菌活性测定 抑菌圈法
2020-11-19发布
2020-11-19实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位:中国计量大学、中国标准化研究院。
本标准主要起草人:申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、许益鹏、崔海峰、张雅芬。
微生物源抗生素类次生代谢产物
抗细菌活性测定 抑菌圈法
1 范围
本标准规定了用抑菌圈法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性的方法。
本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗细菌活性测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全要求
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
IC50
对细菌的抑制率达到50%时的浓度。
3.2
抑制细菌生长繁殖的能力。
3.3
抑菌圈 inhibitionzone
固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域。
4 原理
利用待测次生代谢产物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制形成的抑菌圈大小,计算
IC50来判定活性。
5 实验室生物安全要求
应符合GB 19489的规定。
6 试剂或材料
除非另有规定,所用试剂均为分析纯。
6.1 水。GB/T 6682一级水。
6.2 LB液体培养基。称取胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g,然后将上述各成分加于
1000mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0±0.2,分装至锥形瓶中,121℃灭菌20min。
6.3 LB固体培养基。称取胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20.0g,然后将上述
各成分加于1000mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.0±0.2,分装至250mL锥形瓶中,121℃灭菌
20min。
6.4 指示菌标准菌株:
也可以采用其他标准菌株作为供试菌,具体可参照实际情况进行选择。
7 仪器设备
7.1 恒温培养箱:温度偏差在±1℃以内。
7.2 无菌培养皿:带陶瓦盖,直径90mm。
7.3 无菌牛津杯:不锈钢,标准规格:内径6mm、外径8mm、高10mm。
7.4 抑菌圈测量仪:精度0.1mm。
7.5 分光光度计:检测波长600nm。
7.6 无菌锥形瓶:容量100mL、250mL。
7.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器。
8 操作步骤
8.1 菌株活化
将菌株接种到装有2mL的LB液体培养基的试管中,37℃±1℃下培养12h~18h。用接种环挑
取菌悬液以划线法接种到LB固体平板上,37℃±1℃恒温培养箱中培养18h~24h,然后从平板中挑
取单菌落接种在LB固体培养基试管斜面内,37℃±1℃恒温培养箱中培养18h~24h,后将试管斜面
贮存于1℃~4℃冰箱内作为保存菌,保存期不超过一个月,每月传代一次,传代次数不超过10代。
8.2 菌悬液制备
8.2.1 用接种环取保存菌,以划线法接种到LB固体平板上,37℃±1℃下培养24h。
注:LB固体平板在1℃~4℃条件下保存,1周内使用。
8.2.2 取LB液体培养基20mL加入容量为100mL的无菌锥形瓶内,用接种环取8.2.1平皿上的单菌
落接种在LB液体培养基内,37℃±1℃培养12h~18h。
8.2.3 用LB液体培养基调节培养后的菌浓度至1×108CFU/mL~5×108CFU/mL并以此作为试验
菌悬液。采用分光光度计测定试验菌悬液OD600为0.5~0.65或(其他)适当的方法测定菌悬液浓度。
注:试验菌悬液在1℃~4℃条件下保存,在4h内使用。
8.3 供试样品制备
极性样品直接用水充分溶解(非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解),配制成一定浓度的
母液,经无菌0.45μm滤膜过滤,然后用无菌水(或相应的表面活性剂)按2倍或5倍浓度逐级稀释,制
备成至少5个不同浓度的待测溶液;逐级稀释时应确保既有抑制率大于50%分布的浓度点,也有抑制
率小于50%分布的浓度点,现配现用。
8.4 检测平板制备
将8.2.3中的菌悬液用冷却至55℃左右的LB固体培养基按1∶10的比例稀释,充分混匀后取
15mL于无菌培养皿内,轻轻摇动平板使菌液均匀铺平,待其凝固后制成检测平板,备用。
8.5 抑菌活性测定
分别将无菌牛津杯轻轻地放在8.4制备的检测平板中,而后用无菌吸管分别将8.3中制备的200μL
不同浓度的供试样品溶液加入牛津杯中,空白对照组加入200μL对应的溶剂,每个处理重复5次。将
平板正置于37℃±1℃恒温培养箱中培养12h~18h,取出,用抑菌圈测量仪测量待测样品和空白对
照组形成的抑菌圈直径。
9 结果计算
抑制率按式(1)计算:
I=
D1-D2
D2 ×
100% (1)
式中:
I ---抑制率;
D1---供试次生代谢产物平板中形成的抑菌圈直径,单位为毫米(mm);
D2---空白对照平板中形成的抑菌圈直径,单位为毫米(mm)。
以五个平行样的平均值......
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