路径: 主页 > SN/T > 第70页 > SN/T 5206-2020 | 标准编号 | SN/T 5206-2020 (SN/T5206-2020) | | 中文名称 | 洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法 | | 英文名称 | (Quarantine and identification methods of onion yellow dwarf virus) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B16 | | 国际标准分类 | 65.020.01 | | 字数估计 | 11,187 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5206-2020
Detection and identification of onion yellow dwarf virus
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
代替 SN/T 1162-2002
中华人民共和国海关总署 发 布
2020-12-30发布
2021-07-01实施
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关、中国检验检疫科学研
究院、中国农业科学院生物技术研究所、福建农林大学。
本文件主要起草人：沈建国、林玲、黄智辉、张永江、李为民、陈细红、廖富荣、高芳銮、周
卫川、吴祖建、陈寿铃。
洋葱黄矮病毒的检疫鉴定方法
1 范围
本文件规定了洋葱黄矮病毒检测的程序和方法。
本文件适用于进出境植物及其产品中洋葱黄矮病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用
文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）
适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T 2964 植物病毒检测规范
SN/T 3457 植物病毒分子生物学检测规范
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 原理
洋葱黄矮病毒的血清学特性和基因组特征是制定本检疫鉴定方法的主要依据。
5 仪器设备、用具及试剂
5.1 仪器设备
高速冷冻离心机、电子天平（1/1000 g）、酶联仪、PCR 仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰
箱和 -80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH 计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌
锅、超净工作台等。
5.2 用具
各种量程的可调移液器（1000 μL、200 μL、100 μL、20 μL、10 μL、2 μL）、PCR 反应管、离心管
（1.5 mL）、研钵等。
5.3 试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。DAS-ELISA 试剂
见附录 A、RT-PCR 试剂见附录 B。
6 抽样和样品制备
6.1 抽样
抽样方法按照 SN/T 2122 相关中规定执行。
有病毒危害症状的植物材料单独抽样，OYDV 的危害症状描述参见附录 C；无危害症状的植物材
料抽样方法按照 SN/T 2122 中相关规定执行。
6.2 样品制备
分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照 SN/T 2964 和 SN/T 3457 中规定执行。
7 检测与鉴定
7.1 DAS-ELISA
DAS-ELISA 具体方法见附录 A。
7.2 RT-PCR
RT-PCR 具体方法见附录 B。
8 结果判定与记录
8.1 结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：
首先采用 DAS-ELISA 进行初步筛检。
8.2 结果记录
记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS-
ELISA 检测应有酶联反应数值；RT-PCR 检测应有电泳图片。
9 样品的保存
将经检测结果判定为阳性的样品妥善保存在-20℃～-80℃冰箱中，并做好登记和标记工作，以
备复核用。
附 录 A
（规范性）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
A.1 试剂
A.1.1 包被抗体
特异性的洋葱黄矮病毒抗体。
A.1.2 酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的洋葱黄矮病毒抗体。
A.1.3 底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。
A.1.4 1×PBST缓冲液（pH 7.4）
A.1.5 样品抽提缓冲液（pH 7.4）
A.1.6 包被缓冲液（pH 9.6）
A.1.7 酶标抗体稀释缓冲液（pH 7.4）
A.1.8 底物缓冲液（pH 9.8)
A.2 试验方法
A.2.1 样品制备
A.2.1.1 待测样品
待测样品按 1：10（重量：体积，W/V）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，8 000 g 离心 10 min，
上清即为制备好的检测样品。
A.2.1.2 阳性对照样品
洋葱黄矮病毒的纯病毒或者组织抽提液由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。
A.2.1.3 阴性对照样品
由抗血清供应商提供，用抽提缓冲液制备。
A.2.1.4 空白对照
用抽提缓冲液作空白对照
A.2.2 包被抗体
按说明用包被缓冲液将抗体稀释，加入酶联板的孔中，100 μL/孔，加盖，37℃孵育 2 h 或 4℃冰
箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST 洗涤 4～6 次，每次 1 min。
A.2.3 加样
加入制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照，空白对照，并且至少一个重复，100 μL/孔，加
盖，37℃孵育 2 h 或 4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST 洗涤 4～6 次。
每次 1 min。
A.2.4 加酶标抗体
按说明用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度，加入到酶联板中，100 μL/孔，加盖，
37℃孵育 2 h，倒去酶联板孔中溶液，按每孔 100 μL 的量用 PBST 洗涤 4～6 次，每次 1 min。
A.2.5 加底物
将底物 ρNPP 加入到底物缓冲液中使终浓度为 1 mg/mL（现配现用），加入到酶联板中，100 μL/
孔，室温避光孵育。
A.2.6 测定光密度
酶联仪在 405 nm 处测定光密度（OD 值）。
A.3 结果判断
在满足阴性对照孔的 OD405 值 < 0.15......
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