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基本信息
标准编号 GB 5009.33-2010 (GB5009.33-2010)
中文名称 食品安全国家标准　食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定
英文名称 National food safety standard -- Determination of nitrite and nitrate in foods
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 67.040
字数估计 16,130
发布日期 2010-03-26
实施日期 2010-06-01
旧标准 (被替代) GB/T 5009.33-2008
引用标准 GB/T 6682
标准依据 卫通(2010)7号;国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号
发布机构 中华人民共和国卫生部
范围 本标准规定了食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法。本标准适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。

GB 5009.33-2010: 食品安全国家标准　食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 GB 5009.33-2010 英文名称: National food safety standard -- Determination of nitrite and nitrate in foods 中华人民共和国国家标准 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 1 范围 本标准规定了食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定方法。 本标准适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。 第一法 离子色谱法 5 分析步骤 5.1 试样预处理 5.1.1 新鲜蔬菜、水果：将试样用去离子水洗净，晾干后，取可食部切碎混匀。将切碎的样品用四分 法取适量，用食物粉碎机制成匀浆备用。如需加水应记录加水量。 5.1.2 肉类、蛋、水产及其制品：用四分法取适量或取全部，用食物粉碎机制成匀浆备用。 5.1.3 乳粉、豆奶粉、婴儿配方粉等固态乳制品(不包括干酪) ：将试样装入能够容纳 2 倍试样体积的 带盖容器中，通过反复摇晃和颠倒容器使样品充分混匀直到使试样均一化。 5.1.4 发酵乳、乳、炼乳及其他液体乳制品：通过搅拌或反复摇晃和颠倒容器使试样充分混匀。 5.1.5 干酪：取适量的样品研磨成均匀的泥浆状。为避免水分损失，研磨过程中应避免产生过多的热量。 5.2 提取 5.2.1 水果、蔬菜、鱼类、肉类、蛋类及其制品等：称取试样匀浆 5 g（精确至 0.01 g，可适当调整试 样的取样量，以下相同），以 80 mL 水洗入 100 mL 容量瓶中，超声提取 30 min，每隔 5 min 振摇一次， 保持固相完全分散。于 75 ℃水浴中放置 5 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤 后，取部分溶液于 10 000 转/分钟离心 15 min，上清液备用。 5.2.2 腌鱼类、腌肉类及其它腌制品：称取试样匀浆 2 g（精确至 0.01 g），以 80 mL 水洗入 100 mL 容 量瓶中，超声提取 30 min，每 5 min 振摇一次，保持固相完全分散。于 75 ℃水浴中放置 5 min，取出放 置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤后，取部分溶液于 10 000 转/分钟离心 15 min，上清液备用。 5.2.3 乳：称取试样 10 g（精确至 0.01 g），置于 100 mL 容量瓶中，加水 80 mL，摇匀，超声 30 min， 加入 3 %乙酸溶液 2 mL，于 4 ℃放置 20 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。 5.2.4 乳粉：称取试样 2.5 g（精确至 0.01 g），置于 100 mL 容量瓶中，加水 80 mL，摇匀，超声 30 min， 加入 3 %乙酸溶液 2 mL，于 4 ℃放置 20 min，取出放置至室温，加水稀释至刻度。溶液经滤纸过滤，取上清液备用。 5.2.5 取上述备用的上清液约 15 mL，通过 0.22 μm 水性滤膜针头滤器、C18 柱，弃去前面 3 mL（如果 氯离子大于 100 mg/L，则需要依次通过针头滤器、C18 柱、Ag 柱和 Na 柱，弃去前面 7 mL），收集后面洗脱液待测。 固相萃取柱使用前需进行活化，如使用 OnGuard II RP 柱（1.0 mL）、OnGuard II Ag 柱（1.0 mL） 和 OnGuard II Na 柱（1.0 mL）1，其活化过程为：OnGuard II RP 柱（1.0 mL）使用前依次用 10 mL 甲 醇、15 mL 水通过，静置活化 30 min。OnGuard II Ag 柱（1.0 mL）和 OnGuard II Na 柱（1.0 mL）用 10 1给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 mL 水通过，静置活化 30 min。 5.3 参考色谱条件 5.3.1 色谱柱：氢氧化物选择性，可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换柱，如 Dionex IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm（带 IonPac AG11-HC 型保护柱 4 mm×50 mm）1，或性能相当的离子色谱柱。 5.3.2 淋洗液 5.3.2.1 一般试样：氢氧化钾溶液，浓度为 6 mmol/L～70 mmol/L；洗脱梯度为 6 mmol/L 30 min，70 mmol/L 5 min，6 mmol/L 5 min； 流速 1.0 mL/min。 5.3.2.2 粉状婴幼儿配方食品：氢氧化钾溶液，浓度为 5 mmol/L～50 mmol/L；洗脱梯度为 5 mmol/L 33 min， 50 mmol/L 5min，5 mmol/L 5 min；流速 1.3 mL/min。 5.3.3 抑制器：连续自动再生膜阴离子抑制器或等效抑制装置。 5.3.4 检测器：电导检测器，检测池温度为 35 ℃。 5.3.5 进样体积：50 μL（可根据试样中被测离子含量进行调整）。 5.4 测定 5.4.1 标准曲线 移取亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液，加水稀释，制成系列标准溶液，含亚硝酸根离子浓度为 0.00 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L、0.06 mg/L、0.08 mg/L、0.10 mg/L、0.15 mg/L、0.20 mg/L；硝酸根 离子浓度为 0.0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L 的混合 标准溶液，从低到高浓度依次进样。得到上述各浓度标准溶液的色谱图（图 1）。以亚硝酸根离子或硝 酸根离子的浓度（mg/L）为横坐标，以峰高（μS）或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算线性回归方程。 5.4.2 样品测定 分别吸取空白和试样溶液 50 μL，在相同工作条件下，依次注入离子色谱仪中，记录色谱图。根据 保留时间定性，分别测量空白和样品的峰高（μS）或峰面积。 6 分析结果的表述 试样中亚硝酸盐（以 NO2-计）或硝酸盐（以 NO3-计）含量按式（1）计算： 7 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值差不得超过算术平均值的 10 %。第二法 分光光度法 8 原理 亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺法测定，硝酸盐采用镉柱还原法测定。 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙 二胺偶合形成紫红色染料，外标法测得亚硝酸盐含量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸 盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。 9 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。水为 GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。 9.1 亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6·3H2O）。 9.2 乙酸锌（Zn(CH3COO)2·2H2O）。 9.3 冰醋酸（CH3COOH）。 9.4 硼酸钠（Na2B4O7·10H2O）。 9.5 盐酸（ρ＝1.19 g/mL）。 9.6 氨水（25 %）。 9.7 对氨基苯磺酸(C6H7NO3S）。 9.8 盐酸萘乙二胺(C12H14N2·2HCl）。 9.9 亚硝酸钠（NaNO2）。 9.10 硝酸钠（NaNO3）。 9.11 锌皮或锌棒。 9.12 硫酸镉。 9.13 亚铁氰化钾溶液(106 g/L)：称取 106.0 g 亚铁氰化钾（9.1），用水溶解，并稀释至 1000 mL。 9.14 乙酸锌溶液(220 g/L)： 称取 220.0 g 乙酸锌（9.2），先加 30 mL 冰醋酸（9.3）溶解，用水稀释至1000 mL。 9.15 饱和硼砂溶液(50 g/L)： 称取 5.0 g 硼酸钠（9.4），溶于 100 mL 热水中，冷却后备用。 9.16 氨缓冲溶液（pH 9.6～9.7）：量取 30 mL 盐酸（9.5），加 100 mL 水，混匀后加 65 mL 氨水（9.6）， 再加水稀释至 1000 mL，混匀。调节 pH 至 9.6～9.7。 9.17 氨缓冲液的稀释液：量取 50 mL 氨缓冲溶液（9.16），加水稀释至 500 mL，混匀。 9.18 盐酸(0.1 mol/L)： 量取 5 mL 盐酸，用水稀释至 600 mL。 9.19 对氨基苯磺酸溶液（4 g/L）：称取 0.4ｇ对氨基苯磺酸（9.7），溶于 100 mL 20 %（V/V）盐酸中， 置棕色瓶中混匀，避光保存。 9.20 盐酸萘乙二胺溶液（2 g/L）：称取 0.2 g 盐酸萘乙二胺（9.8），溶于 100 mL 水中, 混匀后，置棕色瓶中，避光保存。 9.21 亚硝酸钠标准溶液（200 μg/mL）：准确称取 0.1000ｇ于 110℃～120℃干燥恒重的亚硝酸钠，加水 溶解移入 500 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。 9.22 亚硝酸钠标准使用液（5.0 μg/mL）：临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液 5.00 mL，置于 200 mL 容量 瓶中，加水稀释至刻度。 9.23 硝酸钠标准溶液（200 μg/mL，以亚硝酸钠计）：准确称取 0.1232 g 于 110 ℃～120 ℃干燥恒重的 硝酸钠，加水溶解，移于入 500 mL 容量瓶中，并稀释至刻度。 9.24 硝酸钠标准使用液（5 μg/mL）：临用时吸取硝酸钠标准溶液 2.50 mL，置于 100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度。 10 仪器和设备 10.1 天平：感量为 0.1 mg 和 1 mg。 10.2 组织捣碎机。 10.3 超声波清洗器。 10.4 恒温干燥箱。 10.5 分光光度计。 10.6 镉柱 10.6.1 海绵状镉的制备：投入足够的锌皮或锌棒于 500 mL 硫酸镉溶液(200 g/L)中，经过 3 h～4 h，当 其中的镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻 法多次洗涤，然后移入组织捣碎机中，加 500 mL 水，捣碎约 2 s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取 20 目～40 目之间的部分。 10.6.2 镉柱的装填：如图 2。用水装满镉柱玻璃管，并装入 2 cm 高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底 时，应将其中所包含的空气全部排出，在轻轻敲击下加入海绵状镉至 8 cm～10 cm 高，上面用 1 cm 高 的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗，末端要穿过橡皮塞与镉柱玻璃管紧密连接。 如无上述镉柱玻璃管时，可以 25 mL 酸式滴定管代用，但过柱时要注意始终保持液面在镉层之上。 当镉柱填装好后，先用 25 mL 盐酸(0.1 mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次 25 mL，镉柱不用时用水 封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。 10.6.3 镉柱每次使用完毕后，应先以 25 mL 盐酸（0.1 mol/L）洗涤，再以水洗两次，每次 25 mL，最后用水覆盖镉柱。 10.6.4 镉柱还原效率的测定：吸取 20 mL 硝酸钠标准使用液，加入 5 mL 氨缓冲液的稀释液，混匀后注 入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流完后，再加 5 mL 水置换 柱内留存的样液。取 10.0 mL 还原后的溶液（相当 10 μg 亚硝酸钠）于 50 mL 比色管中，以下按 11.4 自“吸取 0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80mL、1.00mL”起依法操作，根据标准曲线 计算测得结果，与加入量一致，还原效率应大于 98%为符合要求。 10.6.5 还原效率计算 还原效率按式（2）进行计算。 11 分析步骤 11.1 试样的预处理 11.2 提取 称取 5ｇ（精确至 0.01 g）制成匀浆的试样（如制备过程中加水，应按加水量折算），置于 50 mL 烧杯中，加 12.5 mL 饱和硼砂溶液（9.15），搅拌均匀，以 70 ℃左右的水约 300 mL 将试样洗入 500 mL 容量瓶中，于沸水浴中加热 15 min，取出置冷水浴中冷却，并放置至室温。 11.3 提取液净化 在振荡上述提取液时加入 5 mL 亚铁氰化钾溶液（9.13）, 摇匀, 再加入 5 mL 乙酸锌溶液（9.14）, 以沉淀蛋白质。加水至刻度, 摇匀, 放置 30 min, 除去上层脂肪, 上清液用滤纸过滤, 弃去初滤液 30 mL,滤液备用。 11.4 亚硝酸盐的测定 吸取 40.0 mL 上述滤液于 50 mL 带塞比色管中，另吸取 0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 亚硝酸钠标准使用液（相当于 0.0 μｇ、1.0 μｇ、2.0 μｇ、 3.0 μｇ、4.0 μｇ、5.0 μｇ、7.5 μｇ、10.0 μｇ、12.5 μｇ亚硝酸钠），分别置于 50 mL 带塞比色管中。于 标准管与试样管中分别加入 2 mL 对氨基苯磺酸溶液（9.19），混匀，静置 3 min～5 min 后各加入 1 mL 盐酸萘乙二胺溶液(9.20)，加水至刻度，混匀，静置 15 min，用 2 cm 比色杯，以零管调节零点，于波 长 538 nm 处测吸光度，绘制标准曲线比较。同时做试剂空白。 11.5 硝酸盐的测定 11.5.1 镉柱还原 11.5.1.1 先以 25 mL 稀氨缓冲液（9.17）冲洗镉柱，流速控制在 3 mL/min～5 mL/min（以滴定管代替 的可控制在 2 mL/min～3 mL/min）。 11.5.1.2 吸取 20 mL 滤液于 50 mL 烧杯中，加 5 mL 氨缓冲溶液（9.16），混合后注入贮液漏斗，使流 经镉柱还原，以原烧杯收集流出液，当贮液漏斗中的样液流尽后，再加 5 mL 水置换柱内留存的样液。 11.5.1.3 将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于 100 mL 容量瓶中，继以水流经镉 柱洗涤三次，每次 20 mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀。 11.5.2 亚硝酸钠总量的测定 吸取 10 mL～20 mL 还原后的样液于 50 mL 比色管中。以下按 11.4 自“吸取 0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL”起依法操作。 12 分析结果的表述 12.1 亚硝酸盐含量计算 亚硝酸盐（以亚硝酸钠计）的含量按式（3）进行计算。 12.2 硝酸盐含量的计算 硝酸盐（以硝酸钠计）的含量按式（4）进行计算。 13 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。 第三法 乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定 14 原理 试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，用镀铜镉粒使部分滤液中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。在滤液和已 还原的滤液中，加入磺胺和 N-1-萘基-乙二胺二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光光度计在 538 nm 波长下测其吸光度。 将测得的吸光度与亚硝酸钠标准系列溶液的吸光度进行比较，就可计算出样品中的亚硝酸盐含量和 硝酸盐还原后的亚硝酸总量；从两者之间的差值可以计算出硝酸盐的含量。 15 试剂和材料 测定用水应是不含硝酸盐和亚硝酸盐的蒸馏水或去离子水。 注：为避免镀铜镉柱（16.10）中混入小气泡，柱制备（17.1）、柱还原能力的检查（17.2）和柱再生（17.3）时所用 的蒸馏水或去离子水最好是刚沸过并冷却至室温的。 15.1 亚硝酸钠（NaNO2）。 15.2 硝酸钾（KNO3）。 15.3 镀铜镉柱 镉粒直径 0.3 mm～0.8 mm。也可按下述方法制备。 将适量的锌棒放入烧杯中，用 40g/L 的硫酸镉（CdSO4·8H2O）溶液浸没锌棒。在 24 h 之内，不断 将锌棒上的海绵状镉刮下来。取出锌棒，滗出烧杯中多余的溶液，剩下的溶液能浸没镉即可。用蒸馏水 冲洗海绵状镉 2 次～3 次，然后把镉移入小型搅拌器中，同时加入 400 mL 0.1 mol/L 的盐酸。搅拌几秒 钟，以得到所需粒度的颗粒。将搅拌器中的镉粒连同溶液一起倒回烧杯中，静置几小时，这期间要搅拌 几次以除掉气泡。倾出大部分溶液，立即按 17.1.1 至 17.1.8 中叙述的方法镀铜。 15.4 硫酸铜溶液：溶解 20 g 硫酸铜（CuSO4·5H2O）于水中，稀释至 1000 mL。 15.5 盐酸-氨水缓冲溶液：pH 9.60～9.70。用 600 mL 水稀释 75 mL 浓盐酸（质量分数为 36 %～38 %）。 混匀后，再加入 135 mL 浓氨水（质量分数等于 25 %的新鲜氨水）。用水稀释至 1000 mL，混匀。用精 密 pH 计调 pH 值为 9.60～9.70。 15.6 盐酸(2 mol/L)：160 mL 的浓盐酸（质量分数为 36 %～38 %）用水稀释至 1000 mL。 15.7 盐酸（0.1 mol/L）：50 mL 2 mol/L 的盐酸用水稀释至 1000 mL。 15.8 沉淀蛋白和脂肪的溶液： 15.8.1 硫酸锌溶液：将 53.5 g 的硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶于水中，并稀释至 100 mL。 15.8.2 亚铁氰化钾溶液：将 17.2 g 的三水亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水中，稀释至 100 mL。 15.9 EDTA 溶液：用水将 33.5 g 的乙二胺四乙酸二钠（Na2C10H14N2......