| 标准编号 | GB/T 15670.21-2017 (GB/T15670.21-2017) | | 中文名称 | 农药登记毒理学试验方法 第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验 | | 英文名称 | Toxicological Test Methods for Pesticides Registration - Part 21: Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells in Vivo | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B17 | | 国际标准分类 | 65.100 | | 字数估计 | 10,141 | | 发布日期 | 2017-07-12 | | 实施日期 | 2018-02-01 | | 标准依据 | s Republic of China | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 15670.21-2017
Toxicological test methods for pesticides registration -- Part 21: Unscheduled DNA synthesis (UDS) test with mammalian liver cells in vivo
ICS 65.100
B17
中华人民共和国国家标准
农药登记毒理学试验方法
第21部分:体内哺乳动物肝细胞
程序外DNA合成(UDS)试验
2017-07-12发布
2018-02-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
农药登记毒理学试验方法
第21部分:体内哺乳动物肝细胞
程序外DNA合成(UDS)试验
1 范围
GB/T 15670的本部分规定了体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA合成试验的基本原则、方法和
要求。
本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成试验。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 14925 实验动物 环境及设施
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成。
3.2
正修复的细胞 celinrepair
净核银粒高于本实验室历史性阴性对照值的细胞。
3.3
净核银粒 netnucleargrain;NNG
在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定,计算为核银粒数(NG)减去等于核面积的
细胞质内银粒平均数(CG),即NNG=NG-CG。由各细胞计算NNG数,再将一个培养物或平行培养
物中的细胞NNG汇总。
4 试验目的
体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验用于检测受试物对动物肝细胞诱发DNA修复
的影响。
5 试验概述
体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验是利用哺乳动物进行的体内体细胞遗传毒理学
试验,遗传学终点为原发性DNA损伤。
UDS反应的测定取决于DNA损伤部位切除和取代的碱基数。本试验适用于检测“长程修复”
(20对~30对碱基),对“短程修复”(1对~3对碱基)的敏感性差。而且,由于DNA损伤未修复、错配
修复或错复制均可引起致突变事件,UDS反应并不完全真实反映DNA修复过程。由于本试验检测整
个基因组,敏感性较高,对本试验提供致突变活性的信息缺乏特异性可能有所补偿。
将新分离哺乳动物肝细胞,移入含有胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)的培养瓶中,孵育一定时间后,观
察3H-TdR掺入情况。如果受试物造成细胞DNA损伤,必然引起细胞的自主性DNA修复,在修复过
程中3H-TdR整合入DNA链中,造成3H-TdR在修复中的掺入。再用放射自显影或液闪计数的方法来
观察掺入3H-TdR的量。掺入越多,说明受试物对DNA的损伤越广泛。
6 试验方法
6.1 准备
6.1.1 实验动物和饲养环境
一般选用健康初成年的大鼠,在试验开始时,动物体重变异应不超过同性别平均体重的±20%。选
用常规饲料,饮水不限制。如果受试物掺入饲料进行染毒,应选择适当的饲料以保证受试物充分混合。
动物可单独饲养或同性别分小组笼养,实验动物饲养条件应符合GB 14925的有关规定。
6.1.2 动物试验前准备
试验前动物要在实验动物房环境中至少适应5d时间。将动物随机分为受试物组和对照组。
6.1.3 受试物准备
固体受试物应溶于或悬浮于适当的溶剂/赋形剂中,并于动物染毒前稀释。液体受试物可直接染
毒,或在染毒前稀释。应新鲜制备受试物,除非稳定性资料证明可以贮存。
6.1.4 溶剂/赋形剂
溶剂/赋形剂在所用剂量水平不应产生毒效应,不应与受试物反应。如使用未充分了解的溶剂/赋
形剂,应有其相容性的资料,推荐首先考虑使用水性溶剂/赋形剂。
6.1.5 对照
每个试验都应包括同时进行的阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照。除了受试物染毒不同外,对照
组动物应以与染毒组动物相同的方式进行操作。
阳性对照在暴露水平应预期得到超过本底值的UDS增加。阳性对照剂量应使效应很清楚,但并不
使读片者立即发现其为阳性对照标本片。阳性对照的染毒途径可以不同于受试物染毒途径。常用的阳
性对照物见表1。
6.2 试验步骤
6.2.1 动物的数量和性别
应采用适当的动物数。每组至少有3只可供分析的动物。如已有充分的本底对照数据库,则同时
进行的阴性对照组和阳性对照组仅需1只或2只动物。
如在进行本试验时,已有资料表明同一品系、相同的暴露途径,在不同性别之间毒性无差别,则用单
一性别(优先用雄性)动物即可。当人暴露受试物可能有性别特异性时,可选择适当性别的动物进行
试验。
6.2.2 染毒程序
受试物通常采用一次染毒。
6.2.3 剂量水平
通常设2个剂量组。高剂量应产生毒性,如根据相同的染毒方案更高剂量可产生动物死亡。较低
剂量一般应为高剂量的50%~25%。在较低的无毒性剂量就有特殊生物活性的受试物(如激素和有丝
分裂原)的剂量设置标准要单独考虑,并应逐例评价。如无适当的资料,需进行确定剂量范围的试验,应
在同一实验室利用同一品系、性别的动物和染毒方案。
高剂量也可规定为引起肝脏某些毒性(如核固缩)的剂量。
6.2.4 限量试验
如果单次染毒剂量水平或同一天2次染毒达到2000mg/kg体重,不产生可观察到的毒性效应,并
且根据结构相关化合物的资料预期受试物无遗传毒性,则不需要进行2个剂量水平的完整试验。如果
人暴露的预期量过高,也可在限量试验中应用更高的剂量水平。
6.2.5 染毒
受试物通常用灌胃染毒。如果合理,其他的染毒途径也可接受。一次灌胃的最大液体容积不超过
2mL/100g体重。若利用更高体积,应说明理由。除了在较高浓度毒效应增强的刺激性或腐蚀性物质
外,应调整浓度使受试物容积减少,保证在所有的剂量水平为等容积。
6.2.6 肝细胞制备
动物染毒后12h~16h制备肝细胞。如无明显的阳性反应,则进行早期采样(染毒后2h~4h)。
但是,根据已有的毒物动力学资料也可利用其他采样时间。
以胶原酶原位灌注肝,分离肝细胞,贴壁后,进行哺乳动物肝细胞短期培养。阴性对照组动物的肝
细胞存活率应大于50%。
6.2.7 UDS测定
新分离的哺乳动物肝细胞通常在含3H-TdR的培养液中培养适当时间,如3h~8h。在培养期末,
移去培养基后,细胞再培养在含过量未标记胸腺嘧啶的培养液中,以除去未掺入的放射性;如培养时间
较长可免去此操作。然后,细胞再经淋洗、固定、染色,计数银粒。每个动物制备2个~3个样本片。
7 结果分析和评价
7.1 结果分析
7.1.1 标本片应有足够的形态正常的细胞,以进行 UDS评价。应在显微镜下检查细胞毒性(如核固
缩、放射标记水平降低)。
7.1.2 标本片应在读片前编号。每个动物至少从2个标本片读数100个细胞,如每个动物计数少于
100个细胞,应说明理由。对S期细胞核不计数银粒,但应记录S期细胞的比例。
7.1.3 以适当的方法计数在形态正常细胞的核和胞质中3H-TdR掺入量,以银粒沉淀作为3H-TdR掺
入的根据。
7.1.4 测定核银粒数(NG)和与核面积相当的细胞质内银粒平均数(CG)。CG数可以取细胞内标记最
多的区域,或从接近核的胞质随机选2~3区域的均值。如果合理,可以利用其他的计数方法(如全细胞
计数)。
7.2 结果评价
7.2.1 评价阳性和阴性反应的标准如下:
a) 阳性反应:净核银粒(NNG)高于根据实验室本底对照资料预先设定的阈值,或NNG值高于同
时进行的阴性对照,并有统计学显著性;
b) 阴性反应:NNG在本底对照值的范围内或低于此阈值,或NNG并不显著高于同时进行的阴
性对照。
7.2.2 应考虑数据的生物学关联及多种参数,如动物间变异、剂量-反应关系和细胞毒性。可利用统计
学方法,以有助于评价试验结果。但是统计学意义不应是决定阳性反应的唯一因素。
7.2.3 虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果,但在少数的情况下,所得到的资料不能对受试
物的活性进行明确的判断,虽经多次重复试验,结果仍然是可疑的。
7.2.4 哺乳动物肝细胞体内UDS试验阳性结果表明受试物引起哺乳动物肝细胞DNA损伤,此损伤能
在体外经程序外DNA合成修复;阴性结果表明在本试验条件下受试物不诱导可检测的DNA损伤。
7.2.5 应讨论受试物或其代谢产物到达体循环或靶器官(如系统毒性)的可能性。
8 试验报告
试验报告至少应包括以下内容:
a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;
b) 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况;
c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;
d) 试验摘要;
e) 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAS号)(如已知)、代码(如有)、纯度(或含量)、
剂型、生产日期(批号)、外观性状、配制所用溶剂和方法;
f) 实验动物的种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源(供应商名称、实验动物质量合格证号、实
验动物生产许可证号),检疫、适应情况,实验动物饲养环境,包括温度、相对湿度、饲料、单笼饲
养或群饲、实验动物设施使用许可证号;
g) 剂量和组别,包括选择剂量的原则和依据、动物分组方式和每组每种性别动物数;
h) 试验条件和方法,包括主要仪器和设备、染毒剂量、染毒途径、染毒方案、试验周期、观察指标
等,阳性对照和阴性(溶剂/赋形剂)对照,有关剂量设计的预试验资料(如进行),证明......
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