[PDF] GB/T 38505-2020 - 自动发货. 英文版
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| GB/T 38505-2020 | 225 | GB/T 38505-2020 | 9秒内发货PDF | 转基因产品通用检测方法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | GB/T 38505-2020 (GB/T38505-2020) |
| 中文名称 | 转基因产品通用检测方法 |
| 英文名称 | General detection methods of genetically modified products |
| 行业 | 国家标准 (推荐) |
| 中标分类 | A40 |
| 国际标准分类 | 07.080 |
| 字数估计 | 14,146 |
| 发布日期 | 2020-03-06 |
| 实施日期 | 2020-03-06 |
| 引用标准 | GB/T 6682; GB/T 19495.1; GB/T 19495.3; GB/T 19495.7 |
| 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 |
| 范围 | 本标准规定了转基因产品的定性检测方法。本标准适用于水稻、玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿等及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR通用检测。本标准方法的最低检出限为0.1%(质量分数)。 |
GB/T 38505-2020: 转基因产品通用检测方法
GB/T 38505-2020 英文名称: General detection methods of genetically modified products
1 范围
本标准规定了转基因产品的定性检测方法。
本标准适用于水稻、玉米、大豆、油菜、马铃薯、甜菜、苜蓿等及其加工产品中转基因成分的实时荧光PCR通用检测。
本标准方法的最低检出限为0.1%(质量分数)。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义
GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
18SrRNA基因
转录自18SrDNA,细胞核糖体的组分之一,作为植物内源基因。
3.2
来自花椰菜花叶病毒的35S启动子。
3.3
来自花椰菜花叶病毒的35S终止子。
3.4
NOS终止子
来自胭脂碱合成酶基因的终止子。
4 试剂与材料
除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水符合GB/T 6682中一级水的规格。
4.1 实时荧光PCR预混液
采用经验证符合实时荧光PCR要求的实时荧光PCR预混液。
4.2 500mmol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)
称取18.6g乙二胺四乙酸二钠,加入70mL水中,并用 NaOH 溶液调pH 值至8.0,加水定容至
100mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
4.3 1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐溶液(pH8.0)
称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中,用盐酸调pH值至8.0,加水定容至1000mL。
在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
4.4 TE缓冲液(pH8.0)
分别量取10mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐溶液(4.3)和2mL500mmol/L乙二胺四乙酸二
钠溶液(4.2),加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
4.5 引物和探针
内源和外源基因或元件检测引物和探针序列见表1。引物和探针用TE缓冲液或双蒸水稀释,稀
释浓度见表1。
5 仪器与设备
5.1 分析天平:感量0.1mg。
5.2 生物安全柜。
5.3 实时荧光PCR仪。
5.4 纯水仪。
5.5 涡旋振荡仪。
5.6 微量移液器。
6 操作步骤
6.1 抽样
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行。
6.2 制样
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行。
6.3 试样预处理
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.3的规定执行。
6.4 DNA模板制备
按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.3的规定执行。或可采用具有相同效果的植物基因组DNA提
取试剂盒进行DNA模板制备。
6.5 DNA浓度测定
采用紫外分光光度法测定DNA浓度,将DNA溶液做适当的稀释,于260nm处测定其吸光度,根
据测定的OD值计算DNA浓度(260nm处1OD=50μg/mL双链DNA),OD值应该在0.2~0.8的范
围内。
6.6 实时荧光PCR检测
6.6.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置
以非转基因样品为阴性对照,以对应的转基因植物样品品系或含有相应外源基因的转基因植物样
品基因组DNA,或含有上述片段的质粒标准分子DNA为阳性对照,以水或TE缓冲液为空白对照。
6.6.2 实时荧光PCR反应体系
PCR反应体系见表3或按照经验证符合要求的试剂盒推荐体系进行配制。每个DNA样品做2个
平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中,不要黏附于管壁上,加样后应尽快盖紧管盖。
a 反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整。
6.6.3 仪器设置
设置PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参照仪器使
用说明书。
6.6.4 PCR反应参数
实时荧光PCR扩增反应参数:50℃/2min;95℃/10min;95℃/15s,60℃/60s,大于或等于
40个循环。
注:95℃/10min专门适用于化学变构的热启动Taq酶。以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选PCR扩增试剂体系不同做调整。
6.6.5 PCR反应运行
将PCR反应管依次摆放至实时荧光PCR仪上(上机前注意检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质
泄漏污染仪器),开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。
7 结果分析
7.1 阈值设定
实时荧光PCR反应结束后,设置荧光信号阈值,阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阈值
线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
7.2 质量控制
空白对照:内参基因检测未出现典型扩增曲线,所有外源基因检测未出现典型扩增曲线,或Ct值大
于或等于40。
阴性对照:内参基因检测出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,所有外源基因检测未出现典
型扩增曲线,或Ct值大于或等于40。
阳性对照:内参基因检测出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,所有外源基因检测出现典型
扩增曲线,且Ct值小于或等于34。
8 结果判定与表述
8.1 结果判定
测试样品全部平行反应外源基因检测未出现典型扩增曲线,或Ct值大于或等于40;内源基因检测
出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,则可判定该样品不含所检的外源基因。
测试样品全部平行反应外源基因检测出现典型扩增曲线,Ct值小于或等于36,内源基因检测出现
典型扩增曲线,Ct值小于或等于30,判定该样品含有对应的外源基因。
测试样品全部平行反应外源基因检测出现典型扩增曲线,但Ct值在36~40之间,内源基因检测
Ct值出现典型扩增曲线,且小于或等于30,应在排除污染的情况下重新处理样品上机检测。再次扩增
后的内源基因检测出现典型扩增曲线,且Ct值小于或等于30,外源基因检测出现典型扩增曲线,且Ct
值仍小于4......
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相关标准: GB/T 39995|GB/T 40980|GB/T 38506|GB/T 39995|GB/T 38505-2020|GB/T 38505|