| 标准编号 | GB/T 46660-2025 (GB/T46660-2025) | | 中文名称 | 新型冠状病毒全基因组测序通用技术要求 | | 英文名称 | General technical requirements for whole genome sequencing of SARS-CoV-2 | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | C30 | | 国际标准分类 | 11.100.10 | | 字数估计 | 10,127 | | 发布日期 | 2025-10-31 | | 实施日期 | 2026-11-01 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 46660-2025: 新型冠状病毒全基因组测序通用技术要求
ICS 11.100.10
CCSC30
中华人民共和国国家标准
新型冠状病毒全基因组测序
通用技术要求
2025-10-31发布
2026-11-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会(SAC/TC136)归口。
本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、深圳华大智造科技股份有限公司、四川大学华西医院、
北京医院、予果生物科技(北京)有限公司、天津金匙医学科技有限公司、广州微远基因科技有限公司、伯
杰(青岛)医疗科技有限公司、江苏宏微特斯医药科技有限公司、江苏硕世生物科技股份有限公司、北京
市医疗器械检验研究院(北京市医用生物防护装备检验研究中心)、深圳市疾病预防控制中心、中国海关
科学技术研究中心、中国科学院微生物研究所、中国医学科学院病原生物学研究所、中国科学院北京基
因组研究所(国家生物信息中心)。
本文件主要起草人:刘东来、赵兰青、胡晋君、王逸丛、赵颖、汪周峰、张瑞、夏涵、李立锋、张俊杰、
张春雷、刘利成、张蓉、李达、吕子全、王艺凯、任宇捷、吴林寰、任丽丽、李明锟。
新型冠状病毒全基因组测序
通用技术要求
1 范围
本文件规定了新型冠状病毒全基因组测序方法的要求,描述了相应的试验方法。
本文件适用于对口咽拭子、鼻咽拭子、气道抽吸液、痰液、肺泡灌洗液、其他呼吸道分泌物或病毒培
养物等样品中的新型冠状病毒的全基因组测序,包括宏转录组测序法、多重聚合酶链反应(PCR)测序法
及杂交捕获测序法等。
本文件适用的测序原理包括可逆末端终止测序法、联合探针锚定聚合测序法、单分子纳米孔链测序
法等。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求
GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测 实验室技术要求
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
基因测序 genesequencing
对核酸分子不同碱基类型的测定,即测定组成核酸分子的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸
腺嘧啶(T)或者尿嘧啶(U)等碱基的组成或排列顺序。
[来源:YY/T 1723-2020,3.1]
3.2
对新型冠状病毒进行全基因组测序,以获得完整的基因组信息。
3.3
以特定环境中整个群落作为研究对象,不分离培养,直接提取得到的所有RNA,经过逆转录合成互
补DNA后,进行基因测序。
[来源:GB/T 40226-2021,3.3,有修改]
3.4
多重PCR
多重聚合酶链反应是在同一扩增反应体系中,使用两对以上引物同时扩增出多个核酸片段的扩增
反应。
[来源:GB/T 19915.5-2005,3.2,有修改]
3.5
杂交捕获 hybridizationcapture
对一个或多个基因的核苷酸序列定制目标基因区域特异性探针,与基因组核苷酸进行杂交,并富集
目标基因片段的过程。
[来源:GB/T 37872-2019,3.1.6,有修改]
3.6
阈值循环数 cyclethreshold;Ct
实时监测扩增过程中,反应管内的荧光信号到达指数扩增时经历的循环周期数。
注:主要的计算方式是以扩增过程前3个~15个循环的荧光值的10倍标准差为阈值,扩增曲线与阈值线交汇点的
扩增循环数即为阈值循环数。
[来源:YY/T 1182-2020,3.4,有修改]
3.7
测序片段 reads
高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。
[来源:GB/T 35890-2018,3.2]
3.8
单次运行可读取的质量合格的序列片段长度,通常以碱基数表示。
[来源:YY/T 1723-2020,3.4]
3.9
待测样品的核苷酸序列检测结果覆盖于参考序列上的比例(测序覆盖率=覆盖区域长度÷参考序
列总长度)。
[来源:GB/T 30989-2014,3.30,有修改]
3.10
测序深度 depthofsequencing
待测样品中某个指定的核苷酸被检测的次数。
[来源:GB/T 30989-2014,3.31,有修改]
3.11
标签 barcode
条码 index
一段特征性的脱氧核苷酸短片段,在多样品混合测序时,充当识别特定样品来源的唯一编号。
[来源:GA/T 1693-2020,3.10,有修改]
4 要求
4.1 生物安全
实验室仪器和设备要求符合GB 19489和GB/T 19495.2的规定。实验室应符合生物安全相应规
定,未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的方法灭活前进行核酸提取及临床样品的灭活等操作,应
在生物安全二级实验室(BSL-2)进行,同时采用生物安全三级实验室(BSL-3)的个人防护;感染性材料
或活病毒在采用可靠方法灭活后进行的核酸检测操作应在BSL-2进行。提取后的核酸或反转录的cD-
NA制备后的相关操作可在生物安全一级实验室(BSL-1)进行。
4.2 样品
应对样品的采集、包装、运送、储存、灭活方式和前处理方式等进行验证。
4.3 核酸提取及纯化
应对核酸提取及纯化效率,如产量、纯度及完整性等进行验证。
4.4 病毒核酸质量控制
4.4.1 核酸定量
应对样品中新型冠状病毒的核酸载量进行测定,具体如下。
a) 应对病毒核酸定量方法,如实时荧光定量PCR等方法进行验证。
b) 应对核酸浓度有明确的规定。例如,使用实时荧光定量PCR测定样品中的病毒载量,在Ct
值≤32时,开展全基因组测序;Ct值 >32时,不一定满足高通量测序的核酸浓度要求,但可优
化试验条件后进行测序。
4.4.2 片段分析
宜对病毒核酸片段分析方法进行验证。
4.5 测序文库制备
应对测序文库制备方法进行验证,文库制备方法包括但不限于宏转录组测序法、多重PCR测序法
和杂交捕获测序法等,具体如下。
a) 宏转录组测序法,主要步骤包括:对去除宿主/其他病原体RNA(可选),逆转录,添加接头、文
库扩增(可选)、文库产物纯化和核酸定量、文库产物均一化混合等。
b) 多重PCR测序法,主要步骤包括:对样品核酸的RNA进行逆转录,采用覆盖新型冠状病毒基
因组的扩增引物进行富集扩增,添加接头、文库扩增(可选)、文库产物纯化和核酸定量、文库产
物均一化混合等。应根据新冠变异位点的变化,及时对靶向扩增引物池进行更新。
c) 杂交捕获测序法,主要步骤包括:对样品核酸中的RNA进行逆转录,添加接头、文库扩增(可
选)、采用新型冠状病毒基因组特异的杂交探针进行富集捕获,文库扩增(可选)、文库产物纯化
和核酸定量、文库产物均一化混合等。
4.6 测序文库质量控制
应对测序文库进行质量控制,包括但不限于标签跳转污染率,文库扩增均匀性,文库产物纯化效率、
片段长度、核酸浓度以及均一化混合的数量等。
4.7 测序
对测序文库进行测序,应对测序方法进行验证,测序方法包括可逆末端终止测序、联合探针锚定聚
合测序和单分子纳米孔链测序法等。
4.8 测序数据质量控制
4.8.1 测序读长和有效数据量
应对测序文库的测序读长及数据量进行验证。在规定的测序读长模式下,测序有效数据量应符合
实验室用户规定的要求。
4.8.2 碱基识别质量百分比
统计单次测序中碱基或测序片段识别质量在规定阈值以上的比例,碱基识别质量百分比平均值应
不低于实验室用户规定的要求。
4.9 病毒基因组比对
4.9.1 病毒参考基因组
应以GenBank上的参考株NC_045512.2作为新型冠状病毒参考基因组。
4.9.2 测序覆盖率和测序深度
新型冠状病毒全基因组的测序覆盖率应≥96%且S基因完整,平均测序深度应≥10×。单核苷酸
位点变异(SNV)过滤阈值应符合实验室用户规定的要求。
4.10 病毒基因组组装和分型
4.10.1 病毒基因组组装
在规定的测序覆盖率和测序深度下,对新型冠状病毒的测序结果进行组装,包括基于参考基因组的
组装或从头组装。
应对病毒基因组组装方法进行验证。
4.10.2 病毒基因组分型
对组装得到的新型冠状病毒基因组进行分型,可采用“Pangolin法”“GISAID法”和“Nextstrain法”
等分型方法。
应对病毒基因组分型方法进行验证。
4.10.3 分型准确性
应对分型准确性进行验证。在规定的测序覆盖率和测序深度下,检测的分型结果应与新型冠状病
毒国家标准样品/标准物质型别一致。
4.10.4 变异情况分析
应对单核苷酸位点变异(SNV)和插入/缺失(Indel)等变异类型进行分析,并注释其对应氨基酸的
变化。
5 试验方法
5.1 生物安全
应根据不同工作内容对实验室进行分区,避免交叉污染,包括试剂储存和准备区、样品制备区、核酸
扩增区、文库制备区、高通量测序区、数据分析区等。集中布置形式的实验室设置应遵循“各区独立,单
向流动(注意风向,压力梯度走向),因地制宜,方便工作”的原则。
5.2 样品
样品的采集、包装、运送、储存、灭活方式和前处理方式等,按照《新型冠状病毒肺炎防控方案(第九
版)》中技术指南进行操作。
5.3 核酸提取及纯化
核酸提取及纯化方法包括异硫氰酸胍-苯酚法、离心柱纯化法、磁珠法等,应按照提取试剂说明书的
方法进行试验。
5.4 病毒核酸质量控制
病毒核酸的质量控制方法包括核酸浓度的测定及片段分析,具体如下:
a) 病毒核酸定量方法包括实时荧光定量PCR方法、荧光染料法等,应按照检测试剂说明书的方
法步骤进行试验;
b) 必要时片段分析可使用片段分析仪、毛细管电泳等进行分析。
5.5 测序文库制备
文库制备方法包括不限于宏转录组测序法、多重PCR测序法和杂交捕获测序法等,应按照文库制
备说明书的方法进行试验。对新型冠状病毒标准品进行文库制备,判定结果是否符合4.5的要求。
5.6 测序文库质量控制
文库质控包括清晰标记添加的标签接头、检测文库浓度、检测文库片段大小等,按照文库制备说明
书中指定或推荐的方法进行试验。符合要求的文库产物进行均一化混合,浓度依据测序试剂及测序仪
器的要求。对新型冠状病毒标准品进行文库质控,判定结果是否符合4.6的要求。
5.7 测序方法
测序方法包括可逆末端终止测序、联合探针锚定聚合测序和单分子纳米孔链测序法等,按照测序试
剂说明书、测序仪器说明书的方法进行试验。对新型冠状病毒标准品进行测序,判定结果是否符合4.7
的要求。
5.8 测序数据质量控制
测序数据质控包括去除含接头或质量低的序列、宿主基因组序列等,多重PCR测序法的数据去除
引物序列。测序完成后,进行碱基或测序片段的质量值进行分析和统计。对新型冠状病毒标准品进行
测序数据质控,判定结果是否符合4.8的要求。
5.9 病毒基因组比对
将质控后的数据与参考序列进行基因组比对,获得测序数据与参考序列比对的bam文件。根据公
式(1)和公式(2)分别计算测序覆盖率值和测序平均深度值。判定结果是否符合4.9.2的要求。
CVR=
CVB
GB ×100%
(1)
式中:
CVR---测序覆盖率;
CVB---覆盖到的基因组序列碱基数;
GB ---基因组全部碱基数。
DP=
MB
CVB
(2)
式中:
DP ---测序平均深度;
MB ---总比对碱基数;
CVB---覆盖到的基因组序列碱基数。
5.10 病毒基因组组装和分型
根据与参考序列比对的bam文件检出突变位点,对不符合要求的进行SNV过滤,使用生物信息学
工具和算法对病毒基因组进行组装、修正,获得一致性序列;使用“Pangolin法”“GISAID法”和“Next-
strain法”等对组装后的基因组序列进行分型鉴定,判定新型冠状病毒标准品的分型准确性是否符合
4.10的要求。使用生物信息学工具通过与参考基因组比对、与分型参考株比对确定新增突变位点,并
注释其对应氨基酸的变化等。
参 考 文 献
[1] GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求
[2] G......
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