| 标准编号 | GB/T 46661-2025 (GB/T46661-2025) | | 中文名称 | 细胞分选用磁珠性能检测方法 | | 英文名称 | Magnetic beads performance detection methods for cell separation | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A40 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 26,21 | | 发布日期 | 2025-10-31 | | 实施日期 | 2026-05-01 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 46661-2025: 细胞分选用磁珠性能检测方法
ICS 07.080
CCSA40
中华人民共和国国家标准
细胞分选用磁珠性能检测方法
2025-10-31发布
2026-05-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
目次
前言 Ⅲ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 缩略语 1
5 标本 2
6 粒度 2
7 超顺磁性 2
8 磁回收率 3
9 无菌检查 3
10 内毒素检测 3
11 体外细胞毒性 3
12 细胞活率 4
13 细胞纯度 5
14 细胞得率 6
附录A(资料性) 无菌检查 8
附录B(资料性) 内毒素检测 13
附录C(资料性) 培养基和试剂 16
参考文献 21
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
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牛刚、郭刚、洪超、任辉、郑晓玲、焉丽波、郝利云、王怡、龙腾镶、王炳志、胡璨鑫、付辉、张峰、吴金玲。
细胞分选用磁珠性能检测方法
1 范围
本文件描述了细胞分选用磁珠的性能检测方法。
本文件适用于具有超顺磁性且表面固定有抗体或链霉亲和素等生物活性分子的细胞分选用磁珠的
性能检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 16886.5-2017 医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验
GB/T 19077 粒度分析 激光衍射法
GB/Z 26082 纳米材料直流磁化率(磁矩)测量方法
GB/T 29022 粒度分析 动态光散射法(DLS)
GB/T 30902 无机化工产品 杂质元素的测定 电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)
GB/T 38506-2020 动物细胞培养过程中生化参数的测定方法
GB/T 39729 细胞纯度测定通用要求 流式细胞测定法
GB/T 40268-2021 免疫磁性材料性能检测方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
细胞活率 celviability
活细胞数目占总细胞数目的百分比。
3.2
设门 gating
在流式图分析过程中,选取特定细胞群的操作。
3.3
细胞纯度 celpurity
目标细胞数目占总细胞数目的百分比。
3.4
细胞得率 celyield
分选后获得的目标细胞数目占分选前的目标细胞数目的百分比。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AO:吖啶橙(acridineorange)
CFU:菌落形成单位(colony-formingunit)
DMSO:二甲基亚砜(dimethylsulfoxide)
FSC:前向角散射光(forwardscatter)
PI:碘化丙啶(propidiumiodide)
SSC:侧向角散射(sidescatter)
5 标本
优先采用已建立的细胞系并从认可的贮源获取,如进行上皮型循环肿瘤细胞分选时,可使用 MCF-7
细胞作为目标细胞。在需要特殊细胞时,如能证明其反应的再现性和精确度,应使用直接从活体组织获
取的原代细胞等。
6 粒度
采用光学分析法检测细胞分选用磁珠的粒度,微米级细胞分选用磁珠按照GB/T 19077的规定执
行,纳米级或亚微米级细胞分选用磁珠按照GB/T 29022的规定执行。
7 超顺磁性
7.1 无柱式
取适量细胞分选用磁珠,磁分离去除磁珠保护液并干燥至恒重(干燥步骤按照GB/T 40268-2021
中5.3的规定执行),取干燥至恒重的固体材料,按照 GB/Z 26082规定的振动样品磁强计测量方法
执行。
7.2 有柱式
7.2.1 试剂
一级水。
7.2.2 设备
7.2.2.1 离心机:可在4℃条件下进行20000g的离心。
7.2.2.2 真空干燥箱:56℃±1℃,压力能保持在2.67kPa(20mmHg)以下。
7.2.2.3 电子天平:分度值为0.01mg。
7.2.2.4 振动样品磁强计。
7.2.3 试验步骤和数据处理
取适量细胞分选用磁珠,在4℃条件下,20000g离心约1.5h,待上清液澄清后弃上清液,加少量一
级水混匀磁珠,将混匀后的磁珠转移至已烘干至恒重的玻璃称量瓶中,干燥至恒重(干燥步骤按照
GB/T 40268-2021中5.3的规定执行)。取干燥至恒重的固体材料,按照GB/Z 26082规定的振动样
品磁强计测量方法执行。
8 磁回收率
8.1 细胞分选用磁珠的浓度可通过ICP-OES法检测获得,ICP-OES法按照GB/T 30902的规定执行,
通过计算磁场作用下分离回收得到的磁珠量与原体系中磁珠总量的百分比获得磁回收率。
8.2 无柱式细胞分选用磁珠的浓度也可采用分光光度法检测,按照GB/T 40268-2021中第9章的规
定执行。
9 无菌检查
见附录A。
10 内毒素检测
见附录B。
11 体外细胞毒性
11.1 原理
活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能将外源性 MTT还原成蓝紫色甲瓒物质,甲瓒的生成量与活细
胞的增殖呈正相关。采用含血清培养基对细胞分选用磁珠进行浸提,用浸提液进行细胞的体外培养,通
过酶标分析仪检测甲瓒含量来评估细胞分选用磁珠对细胞的毒性。
11.2 试剂
11.2.1 L929细胞。
11.2.2 血清。
11.2.3 依格尔最低限量基本培养基。
11.2.4 高密度聚乙烯。
11.2.5 PBS工作液:见C.1。
11.2.6 DMSO。
11.2.7 0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA):见C.2。
11.2.8 MTT。
11.2.9 异丙醇:分析纯。
11.3 设备
11.3.1 Ⅱ级生物安全柜。
11.3.2 水浴锅:37℃±1℃。
11.3.3 电子天平:分度值不大于0.01mg。
11.3.4 细胞培养箱:37℃±1℃,适当的湿度,5%CO2,95%空气。
11.3.5 倒置显微镜。
11.3.6 酶标分析仪:配置570nm和650nm滤光片。
11.3.7 血细胞计数板或自动细胞计数仪。
11.3.8 细胞培养瓶或细胞培养皿。
11.3.9 96孔细胞培养板。
11.4 试验步骤
11.4.1 根据细胞分选用磁珠与细胞接触时间长短的不同和细胞分选类型的不同,将细胞分选用磁珠
浸提液的制备方法分为以下3种:
a) 方法1(见11.4.2)适用于与细胞短期(< 24h)接触的细胞分选用磁珠,浸提条件为37℃±1℃浸
提24h±2h;
b) 方法2(见11.4.3)适用于与细胞长期(≥24h)接触的细胞分选用磁珠,浸提条件为37℃±1℃浸
提72h±2h;
c) 方法3适用于阴性分选的有柱式细胞分选用磁珠,按照11.4.3的规定执行,浸提条件为37℃
±1℃,浸提24h±2h。
11.4.2 浸提液的制备方法1如下:
a) 空白对照组:含10%血清培养基;
b) 阴性对照组:向10%血清培养基中加入与洗涤后的磁珠相同质量的高密度聚乙烯材料;
c) 阳性对照组:向10%血清培养基中加入10%DMSO;
d) 细胞分选用磁珠组:根据细胞分选用磁珠的操作说明确定分选1×107 个细胞所需的细胞分选
用磁珠量,取适量细胞分选用磁珠,使用PBS工作液对细胞分选用磁珠进行洗涤(洗涤次数不
超过细胞分选前该磁珠应洗涤的次数),使用含10%血清培养基将经洗涤的分选1×107 个细
胞所需的细胞分选用磁珠稀释至100μL(96孔培养板一个孔的浸提液用量)。
浸提结束后,对浸提液进行磁分离,以获得去除磁珠的浸提液,各组分磁分离条件同细胞分选用磁
珠组,磁分离后的浸提液为各组的100%浸提液。
11.4.3 浸提液的制备方法2如下:
a) 空白对照组:含10%血清培养基;
b) 阴性对照组:含10%血清培养基中加入与细胞分选用磁珠相同体积的PBS工作液;
c) 阳性对照组:含10%血清培养基中加入10%DMSO;
d) 细胞分选用磁珠组:根据细胞分选用磁珠的操作说明确定分选1×107 个细胞所需的细胞分选
用磁珠量,取适量细胞分选用磁珠,使用含10%血清培养基将分选1×107 个细胞所需的细胞
分选用磁珠稀释至100μL(96孔培养板一个孔的浸提液用量)。
浸提结束后,各组液体为100%浸提液。
11.4.4 制备好的浸提液按照GB/T 16886.5-2017中附录C的规定进行试验。
11.5 试验数据处理
按照GB/T 16886.5-2017中C.2.5的规定执行。
12 细胞活率
12.1 原理
基于细胞膜的选择透过性原理,活细胞的细胞膜完整且具有选择透过性,而死细胞或受损细胞的细
胞膜通透性增加。AO为绿色荧光核酸染料,能进入活细胞和死细胞;PI为红色荧光核酸染料,只能进
入死细胞。因此,在活细胞中的AO染料使细胞呈现出绿色荧光;而死细胞中的AO和PI两种染料发
生能量共振转移,使死细胞呈现出红色荧光。通过使用双荧光通道的细胞计数仪采集图像数据,并进行
图像处理和分析,得出细胞的数量和活率。
12.2 试剂
12.2.1 分选缓冲液:见C.3。
12.2.2 AO/PI荧光染料。
12.3 设备
12.3.1 细胞分选用磁珠配套磁分离器。
12.3.2 Ⅱ级生物安全柜。
12.3.3 双荧光细胞计数仪:配置AO/GFP和PI/RFP荧光通道。
12.4 试验步骤
12.4.1 从标本中获取适量分选前的细胞悬液,按照GB/T 38506-2020中5.1.1或5.1.2的规定测定
分选前的细胞悬液的密度。根据细胞悬液的密度,取适量分选前的细胞悬液,按照细胞分选用磁珠及其
配套试剂的操作说明或设备操作说明进行磁性分选,得到分选后的细胞悬液。
12.4.2 预估分选前的细胞悬液或分选后的细胞悬液的细胞密度,根据仪器的线性范围,适当调整细胞
密度,取适量细胞悬液,加入等体积的AO/PI荧光染料,充分吹打混匀。细胞和染料混合后应5min内
进行测定。
12.4.3 启动细胞计数仪,设定细胞类型,根据仪器的上样体积要求取适量细胞和染料的混合液加至细
胞计数板的一个样品腔内,按照仪器操作说明,通过图像分析系统,自动分析细胞活率。
12.5 试验数据处理
按照公式(1)计算细胞活率:
X=
C ×100%
(1)
式中:
X ---细胞活率;
V ---活细胞数目(如发出绿色荧光的细胞),单位为个;
C ---细胞总数目,单位为个。
结果取3次平行试验的算术平均值(3次结果的相对标准偏差绝对值应小于5%),计算结果精确到
小数点后一位。
13 细胞纯度
13.1 原理
通过荧光素标记的单克隆抗体标记待测样品中的目标细胞,使用流式细胞仪,观测总细胞和目标细
胞不同的光学(散射光和荧光)特性,实现样本中的总细胞和目标细胞的区分和计数,以获得目标细胞
纯度。
13.2 试剂
13.2.1 分选缓冲液:见C.3。
13.2.2 荧光素标记的单克隆抗体:根据目标细胞的特性,选择能特异性识别目标细胞的抗体。
13.3 设备
13.3.1 细胞分选用磁珠配套磁分离器。
13.3.2 Ⅱ级生物安全柜。
13.3.3 流式细胞仪。
13.4 试验步骤
按照12.4.1规定的磁性细胞分选试验方法进行磁性细胞分选,取适量分选前的细胞悬液或分选后
的细胞悬液,按照GB/T 39729的规定执行。
13.5 试验数据处理
在FSC/SSC散点图中,对除细胞碎片外的所有主细胞设门。在主细胞散点图中,对目标细胞设
门。按照GB/T 39729的规定计算纯度,纯度需注明目标细胞种类和总细胞种类。结果取3次平行试
验的算术平均值(3次结果的相对标准偏差绝对值应小于5%),计算结果精确到小数点后一位。
14 细胞得率
14.1 试剂
见13.2。
14.2 设备
14.2.1 细胞分选用磁珠配套磁分离器。
14.2.2 Ⅱ级生物安全柜。
14.2.3 血细胞计数板或自动细胞计数仪。
14.2.4 流式细胞仪。
14.3 试验步骤
14.3.1 按照12.4.1规定的磁性细胞分选试验方法进行磁性细胞分选。
14.3.2 按照GB/T 38506-2020中5.1.1或5.1.2的规定测定分选前的细胞悬液和分选后的细胞悬液
密度。
14.3.3 按照第13章规定的方法测定分选前的细胞悬液和分选后的细胞悬液纯度。
14.4 试验数据处理
按照公式(2)计算细胞得率:
Y= ρafter
×Vafter×Pafter
ρbefore×Vbefore×Pbefore
×100% (2)
式中:
Y ---细胞得率;
ρafter ---分选后的细胞悬液密度,单位为个每毫升(个/mL);
Vafter ---分选后的细胞悬液体积,单位为毫升(mL);
Pafter ---分选后的细胞悬液纯度;
ρbefore ---分选前的细胞悬液密度,单位为个每毫升(个/mL);
Vbefore---分选前的细胞悬液体积,单位为毫升(mL);
Pbefore---分选前的细胞悬液纯度。
结果取3次平行试验的算术平均值(3次结果的相对标准偏差绝对值应小于10%),计算结果精确
至小数点后一位。
附 录 A
(资料性)
无菌检查
A.1 概述
A.1.1 无菌检查系用于检查供试品是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了
供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
A.1.2 在无菌条件下进行无菌检查,试验环境达到无菌检查的要求,无菌操作,防止微生物污染,防止
污染的措施不影响供试品中微生物的检出。定期确认单向流空气区域、工作台面及受控环境。定期按
相关的要求进行隔离系统的验证,其内部环境的洁净度符合无菌检查的要求。日常检验时,对试验环境
进行监测与控制。
A.2 培养基和试剂
A.2.1 硫乙醇酸盐流体培养基:见C.5。
A.2.2 胰酪大豆胨液体培养基:见C.6。
A.2.3 胰酪大豆胨琼脂培养基:见C.7。
A.2.4 沙氏葡萄糖液体培养基:见C.8。
A.2.5 沙氏葡萄糖琼脂培养基:见C.9。
A.2.6 马铃薯葡萄糖琼脂培养基:见C.10。
A.2.7 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:见C.11。
A.2.8 0.9%无菌氯化钠溶液:见C.12。
A.2.9 0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。
A.2.10 0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。
A.3 设备
A.3.1 Ⅱ级生物安全柜。
A.3.2 培养箱:温度范围为30℃~35℃、20℃~25℃。
A.3.3 集菌仪。
A.4 试验步骤
A.4.1 培养基的适用性检查
每批无菌检查用硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等符合培养基的无菌性检查及灵
敏度检查的要求。该检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
A.4.1.1 无菌性检查
每批随机取部分培养基,置各培养基规定的温度培养14d,无菌生长。
A.4.1.2 灵敏度检查
A.4.1.2.1 菌种:培养基灵敏度检查所用菌株传代次数不超过5代(从菌种保藏中心获得的常用菌种包
括以下几种,标准菌株为第0代),并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认,以保证试验菌株的生物
学特性。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕
白色念珠菌(Candidaalbicans)〔CMCC(F)98001〕
黑曲霉(Aspergillusniger)〔CMCC(F)98003〕
液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上,接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,
30℃~35℃培养18h~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖
琼脂培养基上,20℃~25℃培养2d~3d,上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无
菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培
养基上,20℃~25℃培养5d~7d或直到获得丰富的孢子,加入适量0.05%聚山梨酯80的pH7.0无
菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等适宜的稀释液,将孢子洗脱,
采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用0.05%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲
液或0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等适宜的稀释液制成适宜浓度的孢子悬液。
A.4.1.2.3 菌悬液若在室温下放置,一般在2h内使用;若保存在2℃~8℃可在24h内使用。黑曲霉
孢子悬液可保存在2℃~8℃,在验证过的贮存期内使用。
A.4.1.2.4 培养基接种:取适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基7管,分别接种不大于100CFU的金黄
色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2管,另1管不接种作为空白对照;取适宜装量的胰酪大豆胨液
体培养基7管,分别接种不大于100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管,另1管不接种
作为空白对照。接种细菌的培养基管培养时间不超过3d,接种真菌的培养基管培养时间不超过5d。
A.4.1.2.5 结果判定:空白对照管无菌生长,若加菌的培养基管均生长良好,判该培养基的灵敏度检查
符合规定。
A.4.2 方法适用性试验
A.4.2.1 进行供试品无菌检查时,先进行方法适用性试验,以确认所采用的方法适合于该供试品的无
菌检查。若检验程序或供试品发生变化可能影响检验结果时,重新进行方法适用性试验。
A.4.2.2 方法适用性试验按B.4.3的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌逐一进行方法确认。
A.4.2.3 菌种及菌液制备:菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。
A.4.2.4 薄膜过滤法:按供试品的无菌检查要求,取每种培养基规定接种的供试品总量,采用薄膜过滤
法过滤,冲洗,在最后一次冲洗液中加入不大于100CFU的试验菌,过滤。加培养基至滤筒内,接种金
黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基;接种枯草芽孢杆菌、白色念
珠菌、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基。另取一装有同体积培养基的容器,加入等量试验菌,
作为对照。置规定温度培养,培养时间不超过5d。
A.4.2.5 结果判断:与对照管比较,如含供试品各容器中的试验菌均生长良好,则说明供试品的该检验
量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可忽略不计,照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌
检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验
条件下有抑菌作用,宜采用增加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法,
消除供试品的抑菌作用,并重新进行方法适用性试验。
A.4.2.6 方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。
A.4.3 供试品的无菌检查
A.4.3.1 供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件与方法适用性试验确认的方法相同。
A.4.3.2 无菌试验过程中,若使用表面活性剂、灭活剂或溶剂等,需先证明其有效性,且对微生物无
毒性。
A.4.3.3 检验数量:一次试验所用供试品最小包装容器的数量,成品每亚批均进行无菌检查。除另有
规定外,批出厂产品及生物制品的原料和半成品最少检验数量按表A.1规定;上市产品抽检的最少检
验数量按表A.2规定。
表A.1 批出厂产品及生物制品的原料和半成品最少检验数量
供试品 批产量(N)/个 接种每种培养基的最少检验数量
注射剂
≤100 10%或4个(取较多者)
100< N≤500 10个
>500
2%或20个(取较少者)
20个(生物制品)
大体积注射剂( >100mL) -
2%或10个(取较少者)
20个(生物制品)
冻干血液制品( >5mL)
每柜冻干≤200 5个
每柜冻干 >200 10个
冻干血液制品(≤5mL......
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