| 标准编号 | GB 5009.96-2016 (GB5009.96-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定 | | 英文名称 | Determination of ochratoxin A in food -- High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column clean-up | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X04 | | 国际标准分类 | 67.050 | | 字数估计 | 26,279 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 23502-2009; GB/T 25220-2010; GB/T 5009.96-2003; SN 0211-1993; SN/T 1746-2006; SN/T 1940-2007 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | | 范围 | 本标准规定了食品中赭曲霉毒素A的测定方法。本标准第一法适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉中赭曲霉毒素A的测定，第二法适用于玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素A的测定，第三法适用于玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等、啤酒等酒类、酱油等产品、生咖啡、熟咖啡中赭曲霉毒素A的测定，第四法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品中赭曲霉毒素A的测定，第五法适用于小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的测定。 | GB 5009.96-2016
Determination of ochratoxin A in food-High performance liquid chromatographic method with immunoaffinity column clean-up
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中赭曲霉毒素A的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB/T 23502-2009《食品中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱
法》、GB/T 25220-2010《粮油检验 粮食中赭曲霉毒素A的测定 高效液相色谱法和荧光光度法》、
GB/T 5009.96-2003《谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定》、SN/T 1746-2006《进出口大豆、油菜籽和
食用植物油中赭曲霉毒素A的检验方法》、SN/T 1940-2007《进出口食品中赭曲霉毒素 A的测定方
法》和SN0211-1993《出口粮谷中棕曲霉毒素A的检验方法》。
本标准与GB/T 23502-2009相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定”;
---增加了第三法免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法和第四法酶联免疫吸附测定法;
---增加了适用范围并优化了提取方法;
---删除了免疫亲和柱层析净化荧光光度法。
食品安全国家标准
食品中赭曲霉毒素A的测定
1 范围
本标准规定了食品中赭曲霉毒素A的测定方法。
本标准第一法适用于谷物、油料及其制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品、葡萄干、胡椒粒/粉中赭曲霉
毒素A的测定,第二法适用于玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素A的测
定,第三法适用于玉米、小麦等粮食产品、辣椒及其制品等、啤酒等酒类、酱油等产品、生咖啡、熟咖啡中
赭曲霉毒素A的测定,第四法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其制品中赭曲霉毒素 A的测定,
第五法适用于小麦、玉米、大豆中赭曲霉毒素A的测定。
第一法 免疫亲和层析净化液相色谱法
2 原理
用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A,经免疫亲和柱净化后,采用高效液相色谱结合荧光检测器测
定赭曲霉毒素A的含量,外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.3 冰乙酸(C2H4O2):色谱纯。
3.1.4 氯化钠(NaCl)。
3.1.5 聚乙二醇[HOCH2(CH2O·CH2)nCH2OH]。
3.1.6 吐温20(C58H114O26)。
3.1.7 碳酸氢钠(NaHCO3)。
3.1.8 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.9 浓盐酸(HCl)。
3.1.10 氮气(N2):纯度≥99.9%。
3.2 试剂配制
3.2.1 提取液Ⅰ:甲醇-水(80+20)。
3.2.2 提取液Ⅱ:称取150.0g氯化钠、20.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中,加水定容至1L。
3.2.3 提取液Ⅲ:乙腈-水(60+40)。
3.2.4 冲洗液:称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于约950mL水中,加水定容至1L。
3.2.5 真菌毒素清洗缓冲液:称取25.0g氯化钠、5.0g碳酸氢钠溶于水中,加入0.1mL吐温20,用水
稀释至1L。
3.2.6 磷酸盐缓冲液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990mL
水中,用浓盐酸调节pH至7.0,用水稀释至1L。
3.2.7 碳酸氢钠溶液(10g/L):称取1.0g碳酸氢钠,用水溶解并稀释到100mL。
3.2.8 淋洗缓冲液:在1000mL磷酸盐缓冲液中加入1.0mL吐温20。
3.3 标准品
赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6,CAS号:303-47-9),纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证
书的标准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 赭曲霉毒素A标准储备液:准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品,用甲醇-乙腈(50+50)溶
解,配成0.1mg/mL的标准储备液,在-20℃保存,可使用3个月。
3.4.2 赭曲霉毒素A标准工作液:根据使用需要,准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液(3.4.1),用
流动相稀释,分别配成相当于1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的标准工作液,4℃
保存,可使用7d。
3.5 材料
3.5.1 赭曲霉毒素A免疫亲和柱:柱规格1mL或3mL,柱容量≥100ng,或等效柱。
3.5.2 定量滤纸。
3.5.3 玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm,无荧光特性。
4 仪器和设备
4.1 分析天平:感量0.001g。
4.2 高效液相色谱仪,配荧光检测器。
4.3 高速均质器:≥12000r/min。
4.4 玻璃注射器:10mL。
4.5 试验筛:孔径1mm。
4.6 空气压力泵。
4.7 超声波发生器:功率 >180W。
4.8 氮吹仪。
4.9 离心机:≥10000r/min。
4.10 涡旋混合器。
4.11 往复式摇床:≥250r/min。
4.12 pH计:精度为0.01。
5 分析步骤
5.1 试样制备与提取
5.1.1 谷物、油料及其制品
5.1.1.1 粮食和粮食制品
颗粒状样品需全部粉碎通过试验筛(孔径1mm),混匀后备用。
提取方法1:称取试样25.0g(精确到0.1g),加入100mL提取液Ⅲ,高速均质3min或振荡
30min,定量滤纸过滤,移取4mL滤液加入26mL磷酸盐缓冲液混合均匀,混匀后于8000r/min离心
5min,上清作为滤液A备用。
提取方法2:称取试样25.0g(精确到0.1g),加入100mL提取液Ⅰ,高速均质3min或振荡
30min,定量滤纸过滤,移取10mL滤液加入40mL磷酸盐缓冲液稀释至50mL,混合均匀,经玻璃纤
维滤纸过滤,滤液B收集于干净容器中,备用。
5.1.1.2 食用植物油
准确称取试样5.0g(精确到0.1g),加入1g氯化钠及25mL提取液Ⅰ,振荡30min,于6000r/min
离心10min,移取15mL上层提取液,加入30mL磷酸盐缓冲液混合均匀,经玻璃纤维滤纸过滤,滤液C
收集于干净容器中,备用。
5.1.1.3 大豆、油菜籽
准确称取试样50.0g(精确到0.1g)(大豆需要磨细且粒度≤2mm)于均质器配置的搅拌杯中,加
入5g氯化钠及100mL甲醇(适用于油菜籽)或100mL提取液Ⅰ,以均质器高速均质提取1min。定
量滤纸过滤,移取10mL滤液并加入40mL水稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液D收集于
干净容器中,备用。
5.1.2 酒类
取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min,过滤或超声脱气)或
其他不含二氧化碳的酒类试样20.0g(精确到0.1g),置于25mL容量瓶中,加提取液Ⅱ定容至刻度,混
匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液E收集于干净容器中,备用。
5.1.3 酱油、醋、酱及酱制品
称取25.0g(精确到0.1g)混匀的试样,加提取液Ⅰ定容至50mL,超声提取5min。定量滤纸过
滤,移取10mL滤液于50mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液
F收集于干净容器中,备用。
5.1.4 葡萄干
称取粉碎试样50.0g(精确到0.1g)于均质器配置的搅拌杯中,加入100mL碳酸氢钠溶液,将搅拌
杯置于均质器上,以22000r/min高速均质提取1min。定量滤纸过滤,准确移取10mL滤液并加入
40mL淋洗缓冲液稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液G收集于干净容器中,备用。
5.1.5 胡椒粒/粉
称取粉碎试样25.0g(精确到0.1g)于均质器配置的搅拌杯中,加入100mL碳酸氢钠溶液,将搅拌
杯置于均质器上,以22000r/min高速均质提取1min。将提取物置离心杯中以4000r/min离心
15min。移取20mL滤液并加入30mL淋洗缓冲液稀释,经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清,滤液 H收
集于干净容器中,备用。
5.2 试样净化
5.2.1 谷物、油料及其制品
5.2.1.1 粮食和粮食制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取提取方法1中全部滤液A或提取方法2中20mL滤
液B,注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通
过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲
和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽干小柱。
5.2.1.2 食用植物油
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取30mL滤液C,注入玻璃注射器中。将空气压力泵
与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,
依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部
流出液,抽干小柱。
5.2.1.3 大豆、油菜籽
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液D,注入玻璃注射器中。将空气压力泵
与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,
依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部
流出液,抽干小柱。
5.2.2 酒类
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液E,注入玻璃注射器中。将空气压力泵
与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,
依次用10mL冲洗液(3.2.4)、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,
抽干小柱。
5.2.3 酱油、醋、酱及酱制品
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液F,注入玻璃注射器中。将空气压力泵
与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,
依次用10mL真菌毒素清洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部
流出液,抽干小柱。
5.2.4 葡萄干
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液G,注入玻璃注射器中。将空气压力泵
与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,
依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽
干小柱。
5.2.5 胡椒粒/粉
将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下,准确移取10mL滤液 H,注入玻璃注射器中。将空气压力泵
与玻璃注射器相连接,调节压力,使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱,直至空气进入亲和柱中,
依次用10mL淋洗缓冲液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱,流速为1滴/s~2滴/s,弃去全部流出液,抽
干小柱。
5.3 洗脱
准确加入1.5mL甲醇或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱,流速约为1滴/s,收集全部洗脱
液于干净的玻璃试管中,45℃下氮气吹干。用流动相溶解残渣并定容到500μL,供检测用。
5.4 试样测定
5.4.1 高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下:
a) 色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;
b) 流动相:乙腈-水-冰乙酸(96+102+2);
c) 流速:1.0mL/min;
d) 柱温:35℃;
e) 进样量:50μL;
f) 检测波长:激发波长333nm,发射波长460nm。
5.4.2 色谱测定
在5.4.1色谱条件下,将赭曲霉毒素A标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪,待
仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x 轴),目标物质的峰面积积为纵坐标(y 轴),对各个数
据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(1)计算:
y=ax+b (1)
式中:
y---目标物质的峰面积比;
a---回归曲线的斜率;
x---目标物质的浓度;
b ---回归曲线的截距。
标准工作溶液和样液中待测物的响应值均应在仪器线性响应范围内,如果样品含量超过标准曲线
范围,需稀释后再测定。
5.4.3 空白试验
不称取试样按5.1、5.2和5.3的步骤做空白试验。应确认不含有干扰待测组分的物质。
6 分析结果的表述
试样中赭曲霉毒素A的含量按式(2)计算:
X=ρ×
V×1000
m×1000 ×f
(2)
式中:
X ---试样中赭曲霉毒素A的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
ρ ---试样测定液中赭曲霉毒素A的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL);
V ---试样测定液最终定容体积,单位为毫升(mL);
1000---单位换算常数;
m ---试样的质量,单位为克(g);
f ---稀释倍数。
计算结果时需扣除空白值,检测结果以两次测定值的算数平均值表示,计算结果保留两位有效
数字。
7 精密度
样品中赭曲霉毒素A含量在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平
均值的15%。
8 其他
粮食和粮食制品、食用植物油、大豆、油菜籽、葡萄干、胡椒粒/粉的检出限和定量限分别为0.3μg/kg
和1μg/kg。酒类的检出限和定量限分别为0.1μg/kg和0.3μg/kg。酱油、醋、酱及酱制品的检出限和
定量限分别为0.5μg/kg和1.5μg/kg。
第二法 离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法
9 原理
用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A,经离子交换固相萃取柱净化后,采用高效液相色谱仪结合荧
光检测器测定赭曲霉毒素A的含量,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。
10.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.3 冰乙酸(C2H4O2)。
10.1.4 石油醚:分析纯,60℃~90℃。
10.1.5 甲酸(CH2O2)。
10.1.6 三氯甲烷(CHCl3)。
10.1.7 碳酸氢钠(NaHCO3)。
10.1.8 磷酸(H3PO4)。
10.1.9 氢氧化钾(KOH)。
10.2 试剂配制
10.2.1 氢氧化钾溶液(0.1mol/L):称取氢氧化钾0.56g,溶于100mL水。
10.2.2 磷酸水溶液(0.1mol/L):移取0.68mL磷酸,溶于100mL水。
10.2.3 碳酸氢钠溶液(30g/L):称取碳酸氢钠30.0g,溶于1000mL水。
10.2.4 乙酸水溶液(2%):移取20mL冰乙酸,溶于980mL水。
10.2.5 提取液:氢氧化钾溶液(0.1mol/L)-甲醇-水(2+60+38)。
10.2.6 淋洗液:氢氧化钾溶液(0.1mol/L)-乙腈-水(3+50+47)。
10.2.7 洗脱液:甲醇-乙腈-甲酸-水(40+50+5+5)。
10.2.8 甲醇-碳酸氢钠溶液(30g/L)(50+50)。
10.2.9 乙腈-2%乙酸水溶液(50+50)。
10.3 标准品
赭曲霉毒素A(C20H18ClNO6,CAS号:303-47-9),纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证
书的标准物质。
10.4 标准溶液配制
10.4.1 赭曲霉毒素 A 标准储备液:准确称取一定量的赭曲霉毒素 A 标准品,用甲醇溶解配制成
100μg/mL的标准储备液,于-20℃避光保存。
10.4.2 赭曲霉毒素A标准工作液:准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液(10.4.1),用甲醇溶解
配制成1μg/mL的标准储备液,于4℃避光保存。
10.4.3 赭曲霉毒素A系列标准工作液:准确移取适量赭曲霉毒素A标准工作液(10.4.2),用甲醇稀释
配制成1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的系列标准工作液。
11 仪器和设备
11.1 高效液相色谱仪配荧光检测器。
11.2 分析天平:感量0.01g和0.0001g。
11.3 固相萃取柱:高分子聚合物基质阴离子交换固相萃取柱,柱规格3mL,柱床重量200mg,或等
效柱。
11.4 氮吹仪。
11.5 涡旋振荡器。
11.6 旋转蒸发仪。
11.7 高速万能粉碎机:≥12000r/min。
11.8 20目筛。
11.9 有机滤膜:孔径0.45μm。
11.10 快速定性滤纸。
12 分析步骤
12.1 试样制备
玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆及咖啡豆等用高速万能粉碎机将样品粉碎,过20目筛后混匀
备用。
12.2 试样提取
12.2.1 玉米
称取试样10.0g(精确至0.01g),加入50mL三氯甲烷和5mL0.1mol/L的磷酸水溶液,于涡旋
振荡器上振荡提取3min~5min,提取液用定性滤纸过滤,取10mL下层滤液至100mL平底烧瓶中,
于40℃水浴中用旋转蒸发仪旋转蒸发至近干,用20mL石油醚溶解残渣后加入10mL提取液,再用涡
旋振荡器振荡提取3min~5min,静置分层后取下层溶液,用滤纸过滤,取5mL滤液进行固相萃取
净化。
12.2.2 稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆
称取试样10.0g(精确至0.01g),加入50mL提取液,于涡旋振荡器上振荡提取3min~5min,用
定性滤纸过滤,取10mL滤液至100mL平底烧瓶中,加入20mL石油醚,涡旋振荡器振荡提取3min~
5min,静置分层后取下层溶液,用滤纸过滤,取5mL滤液进行固相萃取净化。
12.2.3 咖啡
称取试样2.5g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯锥形试管(带盖)中,加入25mL甲醇-碳酸氢钠溶
液于涡旋振荡器振荡提取3min~5min,4000r/min离心10min后上清液用滤纸过滤,取10mL滤液
进行固相萃取净化。
12.2.4 葡萄酒
移取试样10.0g(精确至0.01g)于烧杯中,加入6mL提取液,混匀,再用氢氧化钾溶液调pH至
9.0~10.0进行固相萃取净化。
12.3 试样净化
分别用5mL甲醇、3mL提取液活化固相萃取柱,然后将12.2制备的样品提取液加入固相萃取柱,
调节流速以1滴/s~2滴/s的速度通过柱子,分别依次用3mL淋洗液、3mL水、3mL甲醇淋洗柱,抽
干,用5mL洗脱液洗脱,收集洗脱液于玻璃试管中,于45℃下氮气吹干,用1mL乙腈-2%乙酸水溶液
溶解,过滤后备用。
12.4 高效液相色谱参考条件
高效液相色谱参考条件列出如下:
a) 色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;
b) 柱温:30℃;
c) 进样量:10μL;
d) 流速:1mL/min;
e) 检测波长:激发波长:333nm,发射波长:460nm;
f) 流动相及洗脱条件:
流动相:A:冰乙酸-水(2+100),B:乙腈;
等度洗脱条件:A-B(50+50);梯度洗脱条件:见表1。
表1 流动相及梯度洗脱条件
时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0 88 12
2 88 12
10 80 20
12 70 30
19 50 50
30 50 50
31 0 100
39 0 100
40......
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