| 标准编号 | HJ 1016-2019 (HJ1016-2019) | | 中文名称 | 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法 | | 英文名称 | Water quality - Identification of mutagenicity - Vicia faba root-tip micronucleus test | | 行业 | 环保行业标准 | | 中标分类 | Z16 | | 国际标准分类 | 13.060 | | 字数估计 | 21,223 | | 发布日期 | 2019 | | 实施日期 | 2019-09-01 | | 发布机构 | 生态环境部 | HJ 1016-2019: 水质 致突变性的鉴别 蚕豆根尖微核试验法
HJ 1016-2019 英文名称: Water quality - Identification of mutagenicity - Vicia faba root-tip micronucleus test
中华人民共和国国家环境保护标准
水质 致突变性的鉴别
蚕豆根尖微核试验法
生 态 环 境 部 发 布
1 适用范围
本标准规定了鉴别水样致突变性的蚕豆根尖微核试验法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的致突变性鉴别。
2 规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本
标准。
4 方法原理
将经过浸种催根后长出的蚕豆初生根在试样中暴露一定时间，经恢复培养、固定、染色
后，制片镜检，统计蚕豆根尖初生分生组织区（参见附录 A 图 A.2）细胞微核率。致突变物
可作用于细胞核物质，导致有丝分裂期染色体断裂形成断片、整条染色体脱离纺锤丝、纺锤
丝牵引染色体移动的功能受损。这些移动受到影响的染色体断片或整条染色体不能随正常染
色体移向细胞两极形成子细胞核，而滞留细胞质中形成子细胞微核并引起其数量增加。比较
试样与空白试样蚕豆根尖细胞微核率是否显著增加，可判定样品是否存在致突变性。
5 试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为新制备的去离子
水或蒸馏水，电导率（25℃）≤0.50 mS/m、pH（25℃）在 5.5～7.5 之间。
5.1 调温水：用于浸种（8.2）、催根（8.3）、根尖处理（10.1）的实验用水，需提前放置于
恒温培养箱（6.3）中，25℃±1℃平衡至恒温备用。
5.2 盐酸：ρ（HCl）=1.18 g/ml。
5.3 氢氧化钠（NaOH）。
5.4 乙酸：ρ（C2H4O2）=1.05 g/ml。
5.5 无水乙醇：ρ（C2H6O）=0.79 g/ml。
5.6 碱性品红（C20H20ClN3）。
5.7 偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）或偏重亚硫酸钾（K2S2O5）。
5.8 活性炭粉。
5.9 环磷酰胺（C7H15Cl2N2O2P·H2O），生物试剂（BR），纯度≥99.0%，本标准参比物质。
5.10 盐酸溶液：c（HCl）=1.0 mol/L。
量取 8.3 ml 盐酸（5.2），缓慢加入少量水中，搅拌混匀后用水定容至 100 ml。
5.11 氢氧化钠溶液：c（NaOH）=1.0 mol/L。
称取 4.0 g 氢氧化钠（5.3），加入少量水中，搅拌溶解后用水定容至 100 ml。
5.12 卡诺氏液（乙酸-无水乙醇混合液）：1+3。
将乙酸（5.4）和无水乙醇（5.5）按 1:3 的体积比混合，临用现配。
5.13 乙醇溶液：φ（C2H6O）=70%。
量取无水乙醇（5.5）70 ml，用水定容至 100 ml。
5.14 席夫（Schiff）试剂：
可使用市售的成品试剂。也可按照以下方式配置：
在 100 ml烧瓶中加入 5.0 ml无水乙醇（5.5） 和 0.5 g碱性品红（5.6），振荡溶解 10 min。
将 2.5 g 偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（5.7）溶解于 93 ml 水后，加入上述烧瓶中，混匀，
继续加入 1.5 ml 盐酸（5.2），避光振荡至完全溶解，此时溶液呈浅黄色。再加入 0.2 g 活性
炭粉（5.8），振荡 3 min，过滤溶液使之无色，保存备用。此溶液在 4℃以下冷藏避光可保
存 6 个月，如溶液呈粉红色或出现沉淀，则不可再用。
5.15 SO2漂洗液：w（Na2S2O5或 K2S2O5）=0.5%。
称取 10.0 g 偏重亚硫酸钠或偏重亚硫酸钾（5.7）溶于 90 ml 水中，得到 w（Na2S2O5或
K2S2O5）=10%的溶液。分别吸取该溶液和盐酸溶液（5.10）各 5.0 ml 于 100 ml 容量瓶中，
用水定容至刻度，临用现配。
5.16 乙酸分散液：φ（C2H4O2）=45%。
量取 45 ml 乙酸（5.4），用水定容至 100 ml，临用现配。
5.17 环磷酰胺参比溶液：ρ（C7H15Cl2N2O2P）=20.0 mg/L。
称取 0.107 g 环磷酰胺（5.9）加入少量水中，搅拌溶解后用水定容至 100 ml。吸取该溶
液 20.0 ml，用水定容至 1 000 ml，临用现配。
6 仪器和设备
配制环磷酰胺参比溶液（5.17）及试样稀释时使用符合国家标准的 A 级玻璃量器，其他
可使用符合国家标准的 B 级玻璃量器。
6.1 冷藏采样箱：0℃～8℃。
6.2 生物显微镜：物镜 10×、20×、40×，目镜 10×或 15×。
6.3 恒温培养箱：25℃±1℃。
6.4 冰箱：冷藏温度 0℃～8℃，冷冻温度≤-18℃。
6.5 电子天平：分度值 0.000 1 g。
6.6 恒温水浴锅：20℃～100℃，控温精度±1℃。
6.7 根尖处理皿：直径≥12 cm、高度≥3 cm，可自制（参见附录 C）。
6.8 生物实验室常用设备和器材。
7 受试生物
受试生物为松滋青皮豆，是原产于湖北省松滋县的一种中粒蚕豆（Vicia faba），经筛选
及长期纯化保种，其遗传特性相对稳定，对致突变物较为敏感。可直接购买或自行保种，其
特性及保种应符合附录 B 的要求。本试验以其初生根为受试器官。
8 受试生物准备
8.1 选种
按照每一试样约需 50 粒松滋青皮豆的数量，挑选颗粒饱满、豆皮青绿或青棕色、大小
一致、无病虫害、表面无明显缺损的豆种，实验用水洗净。
8.2 浸种
按照每 1 000 ml 烧杯中最多 300 粒豆种的数量浸种，在烧杯中加调温水（5.1）过 1 000 ml
刻度，于恒温培养箱（6.3）中 25℃±1℃避光浸泡至豆种充分吸胀。浸种约需 26 h～30 h，
可在 18 h 和 24 h 时换水，若出现浑浊，则增加换水频次。
8.3 催根
将医用纱布浸洗 3 次后拧干，叠 4 层垫入洁净的搪瓷盘内，加少量调温水（5.1）至纱
布充分润湿。调温水（5.1）用量以倾斜搪瓷盘，在最低处见少量溢水为宜。豆种（8.2）用
调温水（5.1）漂洗后，均匀排布于搪瓷盘内，覆盖 2 层充分润湿的纱布，纱布含水量以悬
挂时刚好无水下滴为宜。盖上搪瓷盘盖，于恒温培养箱（6.3）中 25℃±1℃避光催根 62 h～
66 h。
催根期间，每日检查 2 次，注意及时补水保持纱布处于刚被充分润湿的状态，随时去除
不出根、霉变、根尖枯死、根尖形态或颜色异常的豆种，如下垫纱布出现粘性分泌物，及时
清洗更换。
9 样品
9.1 样品采集
按照HJ/T 91或HJ/T 164的要求进行样品采集，根据样品性质选用 1 000 ml及以上容量
的采样瓶。采样瓶可以为棕色玻璃瓶或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器。采样时应
注意将样品沿瓶壁缓慢倒入采样瓶，样品与瓶塞之间不留空隙。
注：为保证尽快开展测试，采样时间应尽量安排在催根（8.3）步骤的末期。
9.2 样品保存
样品采集后，于 8℃以下冷藏避光保存，在 48 h 内进行试验。样品若需长期保存，须
充分混匀分装并留有适当空隙，于-18℃以下冷冻保存，保存期不超过 2 个月。
9.3 试样制备
样品在恒温培养箱（6.3）中 25℃±1℃避光平衡至恒温，充分混匀后，加满至根尖处理皿
（6.7），与盖板间略留空隙，待测。测试前按照 GB/T 6920 方法测定并记录 pH 值。在-18℃
以下保存的样品，应先在不超过 25℃的水浴中轻微振荡解冻，或在 8℃以下冷藏过夜解冻。
注：试样适宜的 pH 值范围为 5.5～8.5，过高或过低的 pH 值可能会对试验产生影响。当试验结果需包
含该影响，或者调节 pH 值会引起样品物理变性、化学反应时，则不调节样品 pH 值；当样品 pH
＜5.5 或＞8.5 时，可用盐酸溶液（5.10）或氢氧化钠溶液（5.11）调节 pH 值至适宜范围。根据监
测目的，可单独或同时对调节前、后的试样开展试验。
9.4 对照试样
9.4.1 用实验用水代替样品，按照与试样制备（9.3）相同步骤制备用于阴性对照试验的空
白试样。
9.4.2 以环磷酰胺参比溶液（5.17）代替样品，按照与试样制备（9.3）相同步骤制备用于
阳性对照试验的参比试样。
10 分析步骤
10.1 根尖处理
挑选初生根长 1.5 cm～2.0 cm 且生长发育良好的豆种（8.3），在 9.3 步骤的每个根尖处
理皿中插入 10～12 粒豆种，确保根尖没入试样至少 1.0 cm，于恒温培养箱（6.3）中 25℃±1℃
避光放置 6 h。
取出豆种，用调温水（5.1）浸洗 3 次（每次 5 min）后，按照 8.3 规定的条件恢复培养
24 h。
处理过程中，根尖如出现附录 D 中描述的急性毒性症状，则按附录 D 的要求增加试样
急性毒性预试验；否则，直接进行后续试验。
10.2 根尖固定
切取顶端 l.0 cm 左右根尖（10.1）置于具盖指管内（同一试样处理的根尖放入一个指管），
加卡诺氏液（5.12）固定 2 h。固定时间最长不超过 24 h。
如不能及时染色制片，则弃去卡诺氏液，用实验用水洗净，加入乙醇溶液（5.13）浸没，
于冰箱内冷藏，72 h 内染色镜检。
10.3 孚尔根（Feulgen）染色
实验用水浸洗根尖（10.2）2 次，每次 5 min。取 60℃水浴平衡后的盐酸溶液（5.10），
快速加入指管内直至浸没根尖，指管加盖后放入 60℃水浴锅中水解约 10 min，具体时间以
根尖软化呈白色略带透明，镊子轻捏不破、有弹性为准。快速弃除盐酸溶液。
立即用实验用水浸洗上述根尖 2 次，每次 5 min。在指管中加入席夫试剂（5.14）直至
浸没根尖，在暗室或避光条件下染色 1 h～2 h。弃除染液，用 SO2漂洗液（5.15）浸洗根尖
2 次，每次 5 min；再用实验用水浸洗根尖 2 次，每次 5 min。
如不能立即制片，将根尖浸泡于新换的实验用水中，冰箱内冷藏，48 h 内制片镜检。
10.4 制片
用镊子轻取染色效果良好的根尖（10.3），在滤纸上吸净表面水分，置于载玻片上，用
手术刀截取约 l.0 mm～2.0 mm 处的顶部根尖（参见附录 A 图 A.2），滴加 1 滴乙酸分散液
（5.16）浸没根尖，手术刀充分捣碎，加盖玻片（避免产生气泡），盖玻片上叠放滤纸，轻
轻敲打以分散根尖组织，拇指按压制成薄片，使根尖细胞呈单层分散状。
10.5 镜检
将制备好的压片（10.4）置于生物显微镜（6.2）下，低倍镜下观察找出根尖细胞接近方
形或椭圆形、分布均匀、不重叠的区域，转入高倍镜下镜检。每一试样至少观察 6 个根
尖，按 10.6 判定规则对每个根尖进行以下统计：
a）1 000 个细胞中处于有丝分裂期的细胞数；
b）1 000 个处于有丝分裂间期细胞中的微核数。
10.6 有丝分裂细胞及微核判定
10.6.1 细胞有丝分裂过程包含分裂间期和有丝分裂期两个阶段，其中有丝分裂期细胞的
识别参见附录 A 图 A.1。
10.6.2 按照以下规则判定微核：
a）大小为主核的 1/3 以下，且与主核分离或相切；
b）着色反应和折光性与主核一致，内部有明显的染色质颗粒，色泽比主核稍浅或相
当；
c）形态圆形、椭圆形或不规则。
形态类似微核，但不符合上述特征，尤其是折光性与主核不一致、内部无明显染色质
颗粒、着色较深或过浅的颗粒即为伪微核。微核及伪微核判定参见附录 A 图 A.3。
10.7 对照试验
10.7.1 阴性对照
每批试样测试时，空白试样（9.4.1）按 10.1～10.6 步骤进行阴性对照试验。
10.7.2 阳性对照
每批试样测试时，参比试样（9.4.2）按 10.1～10.6 步骤进行阳性对照试验。
11.3 试验报告
原始记录表和试验报告表格式参见附录 F，试验报告要求包括但不限于下列信息：
a）松滋青皮豆的来源和收获年份；
b）样品的名称、类别、来源、保存方法，采样时间，试样 pH 调节前后的值等；
c）存在急性毒性的试样，用于正式试验的无急性毒性效应最大浓度；
d）每一试样对应的所有镜检根尖细胞有丝分裂指数的范围；
e）每一试样对应的所有镜检根尖的微核数；
f）对照试验结果中空白试样（阴性对照）和参比试样（阳性对照）微核率；
g）试样微核率，......
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