| 标准编号 | SN/T 5193-2020 (SN/T5193-2020) | | 中文名称 | 兔球虫病检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specifications for rabbit coccidiosis quarantine) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 15,152 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5193-2020: 兔球虫病检疫技术规范
SN/T 5193-2020 英文名称: (Technical specifications for rabbit coccidiosis quarantine)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
兔球虫病检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前 言
本文件按照 GB/T 1.1-2010 的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国太原
海关。
本文件主要起草人：吕继洲、袁向芬、张舟、吴绍强、邓艳、王彩霞、巩红霞、张永宁。
兔球虫病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了兔球虫病检疫时的样品采集、病原形态学观察以及 PCR 检测等技术规范。
本文件适用于活兔、带肝脏兔胴体球虫感染情况的检测，也适用于兔养殖场兔球虫病的流行病
学调查和监测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规模和试验方法
4 疫病概述
参见附录 A。
5 材料
5.1 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到 GB/T 6682 中一级水的要求。
5.2 基因组 DNA抽提试剂盒、PCR 缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、DNA Marker、蛋白酶 K、氯化钠、
重铬酸钾、三氯甲烷、SDS、异丙醇、琼脂糖、无水乙醇等，均为商品化试剂。
5.3 饱和氯化钠溶液、2.5% 重铬酸钾溶液、0.5%SDS消化液、裂解液、20 mg/L蛋白酶K溶液、
酚/三氯甲烷/异戊醇溶液、70% 乙醇、3 mol/L 乙酸钠溶液、电泳缓冲液、生理盐水的配制方
法见附录 B。
5.4 艾美耳球虫 Eimeia spp.通用引物：ITS1-F ：5’-GGGAAGTTGCGTAAATAGA-3’ ； ITS1-R ：
5’- CTGCGTCCTTCATCGAT-3’。引物合成后均采用灭菌 ddH2O 稀释为 10 μmol/L（具体序列见
附录 C）。
5.5 PCR 检测阴阳性对照：阳性对照为 11 种兔球虫 DNA 基因组中的一种，阴性对照为健康兔肝
（肠）组织样品。
6 仪器设备与耗材
天平、镊子、载玻片、漂浮管、自封袋、60目小铜筛、显微镜、制冰机、冰箱（4 ℃、-20 ℃、-
80 ℃）、高压灭菌器、冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪或紫外透射仪、微量可调移液器及
吸头、1.5 mL 离心管等。
7 检测方法
7.1 样品采集
7.1.1 肝脏、肠病灶样品采集
切取肝脏结节病灶、肠粘膜结节病灶组织，每份 20 g 左右，装入干净的自封袋中，标明编号，
记录兔的年龄、品种、饲养卫生条件等，置 4 ℃保存，待处理镜检。
7.1.2 活兔粪便样品采集
活兔隔离检疫期 30 d，隔离第 1天和隔离第 12 天分别采集兔子粪便两次。
取样前，先将一层保鲜膜铺在兔笼下面。3 h 后从保鲜膜上取样，不管兔日龄大小，以兔个体为
单位，采集新鲜粪便一份 20 g 左右。装入干净的自封袋中，标明编号，记录兔的年龄、品种、健康
状况、用药、饲养卫生条件等情况，置 4 ℃保存，待处理镜检。
7.2 形态学鉴定
7.2.1 肝脏、肠病灶镜检
肝组织镜检可见肝细胞萎缩，胆管上皮增生，呈乳头状突起，上皮细胞变性坏死。肝脏组织结节
压片可见大量的球虫卵囊。
肠粘膜坏死脱落，肠粘膜涂片检查可见球虫卵囊。
7.2.2 活兔粪便的处理与镜检
7.2.2.1 每份粪样称取 3 g，用玻璃棒捣碎后与 50 ml 生理盐水搅成混悬液。
7.2.2.2 将粪便混悬液经60目小铜筛过滤到第二个容器内，并将第二个容器内的过滤液倒入离心管中。
7.2.2.3 3 000 r/min 离心 3 min，弃去上清液。
7.2.2.4 向沉淀中加入 10 ml 饱和氯化钠溶液，充分混匀。
7.2.2.5 3 000 r/min 离心 3 min。
7.2.2.6 用捞网捞取表面浮液抖落于盛水的容器中。
7.2.2.7 将卵囊转入已加有 2.5% 重铬酸钾溶液的培养皿中，混匀，液面高度小于 1 cm，做好标记，
放置于 28 ℃摇床内孢子化培养 48 h～72 h，每隔 12 h 观察孢子化情况，孢子化率达到 80%以上，收
集卵囊放于 4 ℃冰箱保存。
7.2.3 形态特征
将卵囊置于载玻片上，100 倍光学显微镜下观察，卵囊呈卵圆形或近似圆形，少数呈椭圆形或梨
形，形态随虫种而定，囊膜壁较厚，一般有两层，能明显看到蛋壳状结构，无色、淡黄色、金黄色
等。在 100 倍光学显微镜下对卵囊定位后，在 400 倍光学显微镜下进一步观察卵囊形状和结构。
兔艾美耳球虫卵囊模式图及 11 种兔球虫卵囊的形态特征见附录 D。
7.3 PCR 检测
7.3.1 PCR 引物
7.3.2 样品制备
取兔球虫卵囊（或病灶组织）沉淀 25 mg 置于离心管按照附录 E 中提取组织 DNA 的方法提取
DNA，也可采用商品化的组织 DNA 提取试剂盒。
7.3.3 PCR 反应体系
取 2 μL 提取的样品 DNA作为模板，加入按照表 1配制的 PCR 反应液中。同时设立阴阳性对照，
设立 ddH2O为空白对照。
7.3.4 PCR 反应程序
94 ℃预变性 2 min ；94 ℃变性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，32 个循环；最后 72 ℃
延伸 7 min ；4 ℃保存。
7.3.5 琼脂糖电泳
取 5 μL PCR扩增产物，进行 1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫外透射
仪观察结果。
7.3.6 结果判定
7.3.6.1 试验成立的条件
阳性对照扩增有目的条带，且经测序比对后其同源性最近序列指向的兔球虫虫种与阳性对照所
属兔球虫虫种一致，阴性对照无相应片段。否则试验无效。
7.3.6.2 可疑判定
样品有扩增条带，判定样品为兔球虫感染可疑。
7.3.6.3 阴性判定
样品无扩增条带，判定样品为兔球虫感染阴性。
7.3.6.4 阳性判定
样品有扩增条带，将扩增获得的产物或电泳条带纯化后，直接测序或进行 T载体克隆测序 。
将测序获得的序列与 Genbank 数据库中的序列进行 BLAST 分析比对，如果同源性最近序列指向
某种兔球虫，可判定样品......
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