| 标准编号 | SN/T 5226-2019 (SN/T5226-2019) | | 中文名称 | 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光PCR方法 | | 英文名称 | (Detection of turtle-derived components in exported foods Real-time fluorescence PCR method) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 67.050 | | 字数估计 | 9,984 | | 发布日期 | 2019 | | 实施日期 | 2020-07-01 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5226-2019: 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光PCR方法
SN/T 5226-2019 英文名称: (Detection of turtle-derived components in exported foods Real-time fluorescence PCR method)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光 PCR 法
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布
机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国大连
海关、中华人民共和国厦门海关。
本标准主要起草人：苗丽、李想、张秀平、黄新新、郭德华、郑秋月、孔凡德、徐淑菲、黄世
英、李志娟。
出口食品中鳖源性成分的检测
实时荧光 PCR 法
1 范围
本标准规定了出口食品中鳖源性成分的实时荧光 PCR 检测方法。
本标准仅适用于食品中中华鳖、黄沙鳖、黑鳖、珍珠鳖、山瑞鳖、刺鳖、小鳖、印度小头鳖和
缅甸缘板鳖等鳖成分的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
5 方法提要
样品经研磨后，提取 DNA，以 DNA 为模板，采用鳖线粒体细胞色素 b 基因的特异性检测引物和
探针，进行实时荧光 PCR 扩增，观察实时荧光 PCR 的增幅现象，判断样品中是否存在鳖成分。
6 试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均
用无 DNA 酶污染的容器分装。
6.1 检测用引物和探针
鳖成分扩增引物和探针详见表 1。鳖引物扩增的靶标序列见附录 A。
6.2 试剂
6.2.1 组织裂解液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）；10%（质量浓度）SDS。
6.2.2 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL）。
6.2.3 饱和酚。
6.2.4 三氯甲烷。
6.2.5 异戊醇。
6.2.6 75% 乙醇。
6.2.7 NaAc 溶液（3 mol/L）。
6.2.8 TE 缓冲液（Tris-HCl、EDTA 缓冲液）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。
6.2.9 实时荧光 PCR 反应混合液：12.5 μL 反应体系包括 1U~3 U 的 Taq 酶、1×PCR 缓冲液、2.5 mmol/L~
4.0 mmol/L 的 Mg2+、0.2 mmol/L 的 dNTP。如果具有等效的商品化试剂盒，也可使用这些等效产品。
7 仪器和设备
7.1 实时荧光 PCR 仪。
7.2 离心机：离心速度不低于 12 000 r/min。
7.3 恒温水浴锅。
7.4 天平：感量 0.1 g、0.01 g。
7.5 微量移液器：10 μL、100 μL 、200 μL、1 000 μL。
7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
7.7 涡旋振荡器。
7.8 研钵及粉碎装置。
7.9 pH 计。
7.10 冰箱 2 ℃~8 ℃、-20 ℃。
8 检验步骤
8.1 DNA 提取
称取待检样品 200 g，研磨混匀，然后称取 100 mg 上述样品于 1.5 mL 离心管中，加入 700 μL 预
热（56 ℃）的组织裂解液和 20 μL 蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL），使用涡旋振荡器混匀，56 ℃水浴 2 h，
期间振荡混匀；向各管加入 700 μL 饱和酚，上下颠倒混匀，12 000 r/min 4 ℃离心 10 min ；转移上清
于洁净离心管中，加入 1/2 上清体积的饱和酚及 1/2 上清体积的三氯甲烷：异戊醇（24 ： 1）上下颠倒
混匀，12 000 r/min 4 ℃ 离心 10 min ；转移上清于洁净离心管中，加等体积的三氯甲烷 ： 异戊醇（24 ： 1）上下
颠倒混匀，12 000 r/min 4 ℃离心 10 min ；转移上清于洁净离心管中，加等体积的三氯甲烷， 12 000 r/min
4 ℃ 离心 10 min ；取上清约 400 μL，加 2.5 倍体积的冷的无水乙醇和 1/10 体积的 NaAc 溶液（3 mol/L），
-20 ℃ 沉淀 2 h 或者沉淀过夜；12 000 r/min 4 ℃ 离心 30 min，弃液，加 1 000 μL 75% 冷的乙醇，
12 000 r/min 4 ℃ 离心 10 min ；弃上清，自然干燥后加入 50 μL TE 缓冲液（pH8.0）溶解 DNA 沉淀，于
-20 ℃保存备用。
注：也可采用等效的 DNA 提取试剂盒提取样品 DNA。
8.2 DNA 浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA
的浓度按照式（1）计算：
8.3 实时荧光 PCR 检测
8.3.1 实时荧光 PCR 反应体系
按照表 2 配制实时荧光 PCR 反应体系。每个样品进行检测时应设置 2 个平行。
8.3.2 实时荧光 PCR 反应参数
实时荧光 PCR 反应条件，随着仪器不同略有改变，一般为：95 ℃/10 min ；95 ℃/15 s，58 ℃/60 s，40
个循环。
8.3.3 实验对照
检验过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含有鳖成分的样品做阳性对照，
用已知不含鳖成分的样品做阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板 DNA 做空白对照。
9 质量控制
9.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于 40.0。
9.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的 Ct 值大于 40.0。
9.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。
10 结果判定及表述
10.1 结果判定
在符合第 9 章的情况下，可做出如下结果判定：
a）如 Ct 值小于等于 35.0，则判定为被检样品阳性；
b）如 Ct 值大于等于 40.0，则判定为被检样品阴性；
c）如大于 35.0 小于 40.0，则重复一次。如再次扩增后 Ct 值仍为小于 40.0，则判定被检样品阳性；
......
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