| 标准编号 | WS/T 571-2017 (WS/T571-2017) | | 中文名称 | 裂头绦虫幼虫检测 | | 英文名称 | Detection of diphyllobothroid larvae | | 行业 | 卫生行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C62 | | 字数估计 | 12,127 | | 发布日期 | 2017-08-01 | | 实施日期 | 2018-02-01 | | 标准依据 | 国卫通(2017)11号;行业标准备案公告2018年第3号(总第219号) | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | WS/T 571-2017: 裂头绦虫幼虫检测
WS/T 571-2017 英文名称: Detection of diphyllobothroid larvae
ICS 11.020
C 62
WS
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
裂头绦虫幼虫检测
1 范围
本标准规定了裂头绦虫幼虫检测的操作流程。
本标准适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构和食品检测机构对鱼、蛙和蛇中裂头绦虫幼虫的检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18088 出入境动物检疫采样标准
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
裂头蚴 plerocercoid larvae
裂头绦虫的幼虫，是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫第三期幼
虫的总称（参见附录A）。
3.2
阔节裂头蚴 plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或 phyllobothrium latum
寄生在鱼体内阔节裂头绦虫的第三期幼虫。
3.3
曼氏裂头蚴 plerocercoid larvae of Spirometra mansoni
寄生在蛙、蛇或人体内曼氏迭宫绦虫的第三期幼虫。
4 仪器器材
4.1 生物显微镜。
4.2 体视显微镜。
4.3 PCR 扩增仪。
4.4 电泳仪。
4.5 凝胶成像系统。
4.6 超净工作台。
4.7 高速离心机。
4.8 解剖用手术器械。
5 试剂材料
5.1 试剂
胃蛋白酶消化液；Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）；琼脂糖凝胶；6×加样缓冲液；100～2000 bp DNA
marker；灭菌双蒸馏水(ddH2O)；70%乙醇（配制见附录 B的 B.1）。
5.2 引物
扩增裂头蚴核糖体 DNA转录间隔区（ITS）引物序列；扩增裂头蚴细胞色素 C氧化酶（Cox1）引物序
列；阔节裂头蚴特异性引物序列及曼氏裂头蚴特异性引物序列（见附录 B的 B.2）。
5.3 阳性对照
阳性对照为裂头绦虫相应基因片段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。
6 检测步骤
6.1 样品准备
6.1.1 样品种类：海鱼、淡水鱼、蛙和蛇。
6.1.2 样品采集：采样按照 GB/T 18088 执行。
6.2 样品检测
6.2.1 压片检查法
用手术剪对受检的鱼、蛙和蛇逐条/只进行解剖。取出内脏，将腹腔壁内膜刮下，观察腹腔内壁表
面，若有可疑白色点状物，用手术剪或手术刀分离皮肉，用两把小镊子将肌肉撕开，取含有白色点状物
的组织用载玻片压片，用生物显微镜镜检判定结果。
6.2.2 蛋白酶消化法
称取样品 250 g并剪成小块，按样品与胃蛋白酶消化液 1:5 的比例加入消化液，37℃消化至无肉眼
可见的肉组织为止。消化后用 0.8mm×0.8mm（10 目）网筛过滤，滤液置于尖底量筒内，加水（用水参
照 GB/T 66828）至最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣置平皿，用体视显微镜镜检判定结果。
6.2.3 核酸检测法
6.2.3.1 取样
在体视显微镜下挑取虫体，初步鉴定后备用。PCR 反应设立阳性对照，对照为裂头绦虫相应基因片
段的阳性克隆质粒或裂头蚴、裂头绦虫全基因组 DNA。无菌水作空白对照。
6.2.3.2 DNA 的提取 （见附录 B 的 B.3）
6.2.3.5 电泳
取 10 L产物与 2 L 的 6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶中。在 1×TAE
缓冲液中，3 V/cm～4 V/cm电泳约 30 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。
6.3 结果判定
6.3.1 裂头属的裂头蚴判定
若从鱼体内检出的幼虫大小若长 2mm~20 mm，宽 2mm~3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各
有一条窄而深凹的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成
虫相似的头节，可初步判定裂头属的裂头蚴（参见附录 C）。
6.3.2 迭宫属的裂头蚴形态判定
若从蛙或蛇体内检出的幼虫大小若长 0.5cm~80 cm，宽 0.3cm~1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫
体前端无吸槽，顶端中央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的
皱褶，可初步判定为迭宫属的裂头蚴（参见附录 C）。
6.3.3 核酸扩增结果判定
6.3.3.1 目的基因扩增片段出现条带而空白对照未出现条带，实验结果成立。
6.3.3.2 阔节裂头蚴特异引物扩增，出现 428 bp 的特征条带，初步判定该虫种为阔节裂头蚴。
6.3.3.3 曼氏裂头蚴特异引物扩增，出现 156 bp 的特征条带，初步判定该虫种为曼氏裂头蚴。
6.3.3.4 若要进一步对幼虫定种，需将引物扩增产物进行测序，将其序列与 GenBank 上序列进行比对后定种。
附 录 A
（资料性附录）
病原学资料
裂头蚴（plerocercoid）是假叶目（Pseudophyllidea）、裂头科（Diphyllobothriidae）绦虫的第三期幼
虫的总称。裂头科中的裂头属（Dibothriocephalus）又名双叶槽属（Diphyllobothrium）及迭宫属
（Spirometra）的裂头蚴可感染人体。
A.1 形态
A.1.1 裂头属的裂头蚴的形态
阔节裂头蚴长 2 mm~20 mm，宽 2mm~3 mm，乳白色，头节呈匙形，其背腹面各有一条窄而深凹
的吸槽，体前端有凹陷且稍大，体不分节但具有横皱褶，尾部细，呈棍棒状，具有与成虫相似的头节，
裂头蚴皮层表面覆盖微毛，长度约 1.5 µm。
A.1.2 迭宫属的裂头蚴形态
曼氏裂头蚴长 0.5cm~80 cm，宽 0.3cm~1 cm，长带形，乳白色或淡黄色，虫体前端无吸槽，顶端中
央有一孔向内凹陷成隧道状，并向后延伸形成盲管，虫体不分节，具有不规则的皱褶。
A.2 生活史
阔节裂头绦虫成虫寄生在人以及犬、猫、猪等动物的小肠内。虫卵随宿主粪便排出后，在 15~25℃
的水中，经过 7d~15d 的发育，孵出钩球蚴。当钩球蚴被剑水蚤吞食后，在其血腔内经过 2 周~3 周的发
育成原尾蚴。当受感染的剑水蚤被小鱼或幼鱼吞食后，原尾蚴可在鱼的肌肉、性腺、卵内发育为裂头蚴，
裂头蚴并可随着鱼卵排出。当大鱼吞食含有裂头蚴的小鱼或鱼卵后，裂头蚴可侵入大鱼的肌肉组织内继
续生存，直到终宿主食入带裂头蚴的鱼时，裂头蚴方能在其肠内经 5 周~6 周发育为成虫。成虫在终宿
主体内可活 5 年~13 年。可感染阔节裂头蚴的第二中间宿主有：白斑狗鱼（Esox lucius）、江鳕（Lota lota）、
河鲈（Perca fluviatilis）、三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）、樱花钩吻鲑（Oncorhynchus masou）、鮻鱼（Liza
haematocheila）、溪红点鲑（Salvelinus fontinalis） 、虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss） 、雅罗鱼属鲤（Leuciscus
rutilus）、八目鳗（Lampetra japonicum）等。
曼氏迭宫绦虫的成虫寄生在猫、犬及食肉野生动物为终宿主的小肠内，虫卵随宿主粪便排出体外，
在适宜温度下，经过 2 周~5 周发育孵出六钩蚴，被剑水蚤吞食后发育成原尾蚴，原尾蚴被蛙类吞食可
发育成裂头蚴，人吞食含有裂头蚴的第二中间宿主可引起曼氏裂头蚴病。可感染曼氏裂头蚴的第二中间
宿主为蛙类；鸟类、蛇类、猪可作为转续宿主。
附 录 B
（规范性附录）
与检测相关的技术方法
B.1 试剂配制
B.1.1 胃蛋白酶消化液
胃蛋白酶2 g，浓盐酸0.7 mL，加蒸馏水至100 mL，现用现配。
B.1.2 Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）
三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）242 g，冰乙酸57.1 mL，pH 8.0的 0.5 mol/L EDTA液100 mL， 加
蒸馏水定容至1000 mL，制成50×TAE缓冲液，混匀4℃保存备用。临用前50倍稀释。
B.1.3 1×TAE使用液，加蒸馏水定容至1000 mL，混匀备用。
B.1.4 10 mg/mL溴化乙锭液
溴化乙锭1 g，加蒸馏水定容至100 mL，磁力搅拌至完全溶解，室温避光保存。
B.1.5 1.5%琼脂糖凝胶
琼脂糖1.5 g，加1×TAE定容至100 mL，完全融化后，溶液冷却至60℃，加10 mg/mL 溴化乙锭5 µL
（终浓度0.5 µg/mL)，轻轻混匀后，制备凝胶。
B.1.6 6×加样缓冲液
溴酚蓝0.25 g，蔗糖40 g，加蒸馏水至100 mL。置4℃保存备用。
B.1.7 商品化试剂盒
Taq酶、dNTP等核酸提取及PCR试剂可选用商品化试剂和试剂盒。
B.2 引物模板
裂头绦虫幼虫相关引物见表B.2
B.3 DNA的提取
B.3.1 挑取单条待鉴定虫体放入灭菌离心管，加入灭菌蒸馏水，半小时换一次水，重复洗涤3次，洗涤
完毕后弃掉离心管中蒸馏水，用碾磨棒将......
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