| 标准编号 | YY/T 1876-2023 (YY/T1876-2023) | | 中文名称 | 组织工程医疗产品 动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法 | | 英文名称 | Tissue engineered medical products - Quantification of remnant DNA in biological materials utilizing animal tissues and their derivatives - Fluorescence method | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C40 | | 国际标准分类 | 11.040.30 | | 字数估计 | 13,121 | | 发布日期 | 2023-01-13 | | 实施日期 | 2024-01-15 | | 发布机构 | 国家药品监督管理局 | | 范围 | 本文件规定了动物源性生物材料中DNA残留量的测定方法。本文件适用于动物源性生物材料及其衍生物的终产品或中间产品、用于组织工程医疗产品基质或支架的动物源性支架材料，也可用于人源脱细胞基质材料。 | YY/T 1876-2023: 组织工程医疗产品 动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法
ICS 11.040.30
CCSC40
中华人民共和国医药行业标准
代替YY/T 0606.25-2014
组织工程医疗产品 动物源性生物材料
DNA残留量测定法:荧光染色法
2023-01-13发布
2024-01-15实施
国家药品监督管理局 发 布
目次
前言 Ⅲ
引言 Ⅳ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 试验原理 2
5 样品、试剂和仪器 2
6 试验过程 3
7 结果计算 6
8 结果判定 7
9 试验报告 7
参考文献 8
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替YY/T 0606.25-2014《组织工程医疗产品 第25部分:动物源性生物材料DNA残留
量测定法:荧光染色法》,与 YY/T 0606.25-2014相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化
如下:
---更改了范围(见第1章,2014年版的第1章);
---更改了规范性引用文件(见第2章,2014年版的第2章);
---删除了术语“基质”(见2014版年的3.1),增加了术语“细胞外基质”“脱细胞”(见3.1和3.6);
---增加了“试验原理”(见第4章),将2014年版的有关内容更改后纳入(见第4章,2014年版的
5.1);
---增加了对供试品灭菌和病毒灭活的要求、增加了其他样品的说明[见5.1的列项a)、b)、c)和
d)],将2014年版的有关内容更改为注(见5.1的注1,2014年版的4.1);
---更改了蛋白酶K消化用试剂的说明(见5.2.1,2014年版的4.2.1);
---更改了其他试剂(见5.2.4,2014年版的4.2.4);
---更改了条款名称,将二级条款编号更改为列项(见5.3,2014年版的4.3);
---更改了“供试品及反应液的准备”(见6.1.1,2014年版的5.2.1.1);
---删除了“回收率样品及反应液的制备”(见2014年版的5.2.1.2),增加了“加标回收样品及反应
液的准备”(见6.1.2);
---增加了“阴性对照样品及反应液的准备”(见6.1.3);
---更改了DNA纯化的操作步骤(见6.2,2014年版的5.2.2);
---增加了“纯化DNA的片段分析”(见6.3),将2014年版的有关内容更改后纳入(见6.3,2014年
版的5.2.2.12的注2);
---更改了“DNA含量测定(荧光染色法)”(见6.4,2014年版的5.2.3);
---更改了结果计算(见第7章,2014年版的第6章);
---更改了结果判定(见第8章,2014年版的第7章);
---增加了“试验报告”(见第9章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会
(SAC/TC110/SC3)归口。
本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、四川大学(四川医疗器械生物材料和制品检验中心)、
冠昊生物科技股份有限公司。
本文件主要起草人:邵安良、徐丽明、李秋、梁洁、许建霞、凌友、黄斯坦、范行良、袁暾。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2014年首次发布为YY/T 0606.25-2014;
---本次为第一次修订。
引 言
由哺乳动物细胞外基质构成的生物源性支架材料被用于外科的创伤修复,肌腱、皮肤、心血管、胃肠
及下尿道组织的重建。这些细胞外基质支架材料取材于人和动物的各种组织,如猪的皮肤、角膜、小肠、
尿道及膀胱、牛的皮肤等。由于细胞膜的表位抗原、细胞核酸(DNA)以及由损伤而来的小分子物质可
能会引起人体广泛的免疫反应,因此动物源性基质材料的脱细胞过程被认为是非常重要的去除免疫原
性工艺。尽管细胞外基质材料已经被广泛用于临床,但仍然存在由于残留DNA及残留蛋白质等所引
起的炎症和免疫反应隐患。因此,动物源性生物材料中,残留DNA定量检测是控制产品质量的重要措
施之一。
目前,国际上还没有对该类产品残留DNA的检测方法标准。国际标准化组织发布了动物源医疗
器械系列标准(ISO 22442),我国已转化为“动物源医疗器械”系列行业标准(YY/T 0771)。此系列标准
包括第1部分“风险管理应用”;第2部分“来源、收集与处置的控制”;第3部分“病毒和传播性海绵状脑
病(TSE)因子去除与灭活的确认”和第4部分“传播性海绵状脑病(TSE)因子的去除和/或灭活及其过
程确认分析的原则”。我国于2009年出台了“动物源性医疗器械产品注册技术审查指导原则”,2017年
发布了修订版。该指导原则在对动物源性医疗器械产品注册申报资料的要求中提到,注册申报资料在
满足一般性要求的基础上,需要增加涉及控制病毒和/或传染性病原感染以及免疫原性风险方面有关的
技术内容。其中要求提供对清除(或降低)动物源性材料免疫原性工艺过程的描述、质量控制指标与验
证性实验数据或相关资料。对于动物源性材料带来的免疫原性风险的降低,一般采用在生产工艺中降
低其免疫原性的方法,包括脱细胞、去除杂蛋白,以及使蛋白质变性等物理的和/或化学的处理步骤,移
走或覆盖抗原决定簇。生产企业需对其降低材料免疫原性的有效性进行验证。其中验证手段之一就是
检测残留DNA含量。基于生物制剂残留DNA检测方法主要包括DNA探针杂交法、荧光染色法及定
量PCR方法(见《中华人民共和国药典》2020年版三部,通则3407外源性DNA残留量测定法),其中荧
光染色法操作简便、灵敏度高、再现性好,得到广泛使用。然而:a)动物源性生物材料来源于动物组织
(主要是基质组织),经脱细胞等工艺制备而成,大多为固体状态(有的为胶体或液体状态),不能直接采
用上述方法检测;b)基质组织中含有大量的结构蛋白质,影响荧光测定的结果。因此,生物制剂残留
DNA检测方法不能直接用于动物源性生物材料残留DNA的定量检测。
本文件给出了适用于动物源性生物材料残留DNA的定量检测方法。
组织工程医疗产品 动物源性生物材料
DNA残留量测定法:荧光染色法
1 范围
本文件规定了动物源性生物材料中DNA残留量的测定方法。
本文件适用于动物源性生物材料及其衍生物的终产品或中间产品、用于组织工程医疗产品基质或
支架的动物源性支架材料,也可用于人源脱细胞基质材料。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
YY/T 0771.1 动物源医疗器械 第1部分:风险管理应用
YY/T 0771.3 动物源医疗器械 第3部分:病毒和传播性海绵状脑病(TSE)因子去除与灭活的
确认
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
细胞外基质 extracelularmatrix;ECM
由细胞产生并分泌到组织内细胞外空间,包括均质状态的基质(蛋白多糖和糖蛋白)和细丝状的胶
原纤维,具有连接和支持细胞的作用,是细胞附着的基本框架和代谢场所,其形态和功能直接影响所构
成的组织形态和功能。
3.2
支架 scaffold
促进替代、修复或再生组织的细胞或生物活性因子迁移、结合或输送的支持物、释放载体或基体。
许多有机物(生物源性物质)、无机物及高分子物质都可以用作组织工程医疗产品的支架材料。
3.3
动物 animal
除人类以外的脊椎动物或无脊椎动物,包括两栖动物、节肢动物(如甲壳类动物)、鸟类、珊瑚虫、鱼
类、爬行动物、软体动物和哺乳动物等。
[来源:YY/T 0771.1-2020,3.1]
3.4
衍生物 derivates
通过制造工艺从动物源性材料中获得的物质。例如:透明质酸、胶原、明胶、单克隆抗体、壳聚糖、白
蛋白等。
3.5
化学交联 chemicalcross-linking
通过化学方法,如化学键的结合,使化合物呈现稳定状态。动物源性基质材料多采用脱细胞处理
和/或结合化学交联方法,达到移走或覆盖抗原表位及DNA及损伤断裂的小分子物质,从而减少和控
制由这些残留物质引起的免疫原性风险。
3.6
脱细胞 decelularization
从生物材料中破坏和/或去除细胞和细胞成分的过程,同时保持细胞外基质材料的关键结构和/或
组成特性。
[来源:ASTM3354:2019,3.1.1]
4 试验原理
本文件设计了动物源性生物材料的残留DNA定量检测三步法,即固体生物材料的蛋白酶K消化
或/和组织匀浆处理、DNA纯化和荧光染色法DNA测定。
试验样品除供试品外,需同步设定加标回收试验样品(即在供试品中添加一定量的DNA对照品)。
一般情况下,核酸提取通常使用以下一种或多种方法:细胞裂解法、组织匀浆法、酶解法和超声波
法。为了获得理想的纯化DNA,建议采用酶解或/和组织匀浆相结合的方法,这种组合方法特别适用于
脱细胞ECM材料难以被消化的情况。为了避免被消化的脱细胞ECM 组分对DNA检测的干扰,用核
酸提取试剂盒对DNA进行纯化。本文件中,核酸染料(如Picogreen荧光染料)被用于双链DNA的定
量检测。
5 样品、试剂和仪器
5.1 样品
样品要求如下:
a) 供试品:脱细胞基质材料(最终成品或半成品)和原材料应按照YY/T 0771.1和YY/T 0771.3
进行灭菌和病毒灭活,确保生物安全;
b) DNA标准曲线样品:采用动物细胞来源的DNA对照品建立标准曲线;
c) DNA纯化加标回收样品:在与待测供试品等量的另一份供试品中加入一定量的DNA对照
品,用于加标回收率测定;
d) 阴性对照样品:由磷酸盐缓冲盐水(PBS)与牛血清白蛋白(BSA)组成,用于排除DNA提取过
程中的污染。
注1:对于由于生产工艺中采取了化学交联等工艺,终产品不易被酶类(蛋白酶K、胰酶等)消化的样品,宜使用化学
交联等工艺前的中间产品。
注2:如果需要对化学交联后不易被酶类消化的终产品进行DNA残留量检测,可采用材料浸提液或者充分匀浆处
理后进行后续试验。此时宜对处理条件作具体规定,并验证其材料中的DNA已得到充分释放和暴露。
5.2 试剂
5.2.1 蛋白酶K消化用试剂
蛋白酶K(-20℃保存,避免反复冻存和融化)、蛋白酶K缓冲液[100mmol/L三羟甲基氨基甲烷
盐酸(Tris-HCl,pH8.0)]、100mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、10mmol/L氯化钙、2%十二烷基
硫酸钠。
注:可采用组织裂解用商品化试剂盒。
5.2.2 DNA纯化用试剂
可选用市售核酸提取试剂盒。所使用试剂盒的DNA纯化加标回收率应满足70%~130%的要求。
5.2.3 荧光染色法检测试剂
注:选用其他双链DNA荧光染料时,按试剂使用说明书配制。
使用者,并不表示对这一产品的认可。
5.2.4 其他试剂
5.2.4.1 对照品DNA:推荐使用国家医药标准物质(动物细胞来源DNA对照品)。
5.2.4.2 焦碳酸二乙酯处理并经高温高压灭菌的纯水(DEPC水)、PBS溶液(无钙镁离子,pH7.0~
7.4)、BSA、20×三羟甲基氨基甲烷盐酸-乙二胺四乙酸二钠缓冲液(TE缓冲液)(200mmol/LTris-
HCl,20mmol/LEDTA,pH7.5)。
5.3 仪器与耗材
5.3.1 磁力架。
5.3.2 黑色96孔板。
5.3.3 荧光酶标仪。
5.3.4 低吸附无DNA酶(DNase-free)无菌离心管。
5.3.5 低吸附无菌吸头。
5.3.6 冷冻离心机。
5.3.7 真空干燥器。
5.3.8 震荡器。
5.3.9 漩涡混悬器。
5.3.10 高精度天平(0.00001g)。
5.3.11 组织匀浆仪。
6 试验过程
6.1 样品消化/匀浆处理
6.1.1 供试品及反应液的准备
供试品及反应液的准备如下。
a) 在样品检测之前,宜制备平行供试品,选择适宜的方法测定其含水量(%),用于计算供试品
干重。
b) 取供试品精确称重(如:5mg~10mg)并记录,放进1.5mLDNase-free无菌离心管内。取
3份平行样作为供试品组,另取3份平行样作为纯化加标回收样品组。不同样品的处理方式
如下。
1) 干燥型样品:直接取供试品精确称重并记录,用于后续试验。
2) 湿润型样品:取供试品,置于1.5mLDNase-free无菌离心管内,15000g离心10min,去
除液体部分,精确称重并记录,用于后续试验。
3) 胶体型样品:取供试品冻干后,精确称重并记录,置于1.5mLDNase-free无菌离心管内,
如果后续的DNA纯化时裂解液的加入能够使胶体型样品分解,则可省略蛋白酶K消化
步骤,直接进行下一步试验。
4) 骨质类样品:对于骨植入物样品,可参照GA/T 383的要求对供试品进行脱钙处理。待脱
钙完全,组织变软后再进行蛋白酶K消化处理。
5) 测试样品不限于上述种类。液态状样品不需要蛋白酶 K消化,取供试品(如:10μL~
20μL)并记录,可直接进行后续的DNA纯化试验。
c) 将上述供试品剪成尽量小的碎片后,加蛋白酶K缓冲液(10×)20μL,蛋白酶K(20mg/mL)
10μL,加DEPC水至最终反应体积为200μL(可根据样品的消化程度调整反应体系)。如果
样品难以消化,则建议结合额外的匀浆步骤。
6.1.2 加标回收样品及反应液的准备
取另一份等量的供试品,经6.1.1处理后,添加一定量的DNA对照品,作为纯化加标回收样品;每
份样品设3个平行样。
注:DNA对照品加入量的设定宜根据待测样品DNA含量的大致范围(参照生产厂家的自检信息或预试验结果),
DNA对照品的加标量尽可能与待测供试品中的DNA含量相近,其差异一般不超过±3倍。
6.1.3 阴性对照样品及反应液的准备
使用PBS(30μL)和3%BSA(70μL)作为阴性对照,加蛋白酶K缓冲液(10×)20μL,蛋白酶K
(20mg/mL)10μL,加DEPC水至最终反应体积为200μL。每份样品设3个平行样。
注:在阴性对照样品中加入3%BSA,并进行蛋白酶K消化,目的是保证与供试品反应系统相同。
6.1.4 蛋白酶K消化
将上述供试品、纯化加标回收样品和阴性对照样品反应液分别混匀后置于56℃水浴槽内消化,至
待测样品完全消化,无肉眼可见颗粒样物为止(消化所需时间因样品不同而异)。
注1:以上反应条件及反应体积可依据样品特点进行优化、调整。消化处理不限于使用蛋白酶K消化,消化条件需
要针对所选择的方法进行优化设计。
注2:本试验所用的所有和样品直接接触的离心管、吸头、移液管等器材均宜保证不含DNA分解酶,以防止样本中
残留DNA被分解。
6.2 DNA纯化
6.2.1 依据所选择的方法及使用的试剂盒所附的操作方法进行DNA纯化。以下使用“宿主细胞残留
DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)”给出DNA纯化步骤示例。
注:如果使用其他试剂盒需按说明书操作。
6.2.2 操作步骤如下。
a) 取消化后的样品200μL,快速离心10s,加入工作结合液209μL,振荡混匀。
b) 快速离心10s,加入200μL异丙醇,30μL磁珠。
c) 将装有全部混合物的离心管置于漩涡振荡器上振荡5min,快速离心10s,静置于磁力架。在
磁力架上分离磁珠时,可以适当旋转离心管,使磁珠吸附更加集中。
d) 待溶液澄清,磁珠完全分离后,轻轻打开管盖,小心移去上清。
e) 加入700μL洗涤液A,振荡10s,然后快速离心10s,静置于磁力架。待溶液澄清,磁珠完全
分离后,去除上清。
f) 加入700μL洗涤液B,振荡10s,然后快速离心10s,静置于磁力架。待溶液澄清,磁珠完全分
离后,去除上清。
g) 再次快速离心10s,静置于磁力架,待磁珠完全分离后,将残余液体去除干净。
h) 打开管盖在室温下干燥5s~10s,除去残留乙醇。在干燥过程中注意观察,勿让磁珠太干,以
免洗脱时磁珠不会完全溶解。
i) 加入50μL洗脱液,用漩涡振荡器轻微振荡使磁珠和洗脱液混匀,70℃水浴7min,水浴过程
中每2min振荡一次,振荡混匀2次~3次。
j) 快速离心10s,静置于磁力架,待磁珠分离后,转移上清液到新离心管中。
k) 重复溶出DNA:加入50μL溶出液,重复i)~j),共2次。将3次溶出液分别保存。
注1:如经验证,单次DNA溶出量接近3次彻底溶出的总量,则可只进行一次溶出。建议供试品DNA残留量为痕
量时,仅一次溶出,最小溶出液体积宜不少于50μL。
注2:纯化后的DNA样品宜立即使用或在保证样品稳定性的适当条件下保存(-20℃及以下,不超过2周)。宜避
免反复的冻存和融化。
6.3 纯化DNA的片段分析
取纯化后的DNA进行凝胶电泳试验,用于检测DNA片段的大小。推荐琼脂糖凝胶浓度为1.5%,
DNA相对分子质量标准品为50bp~2000bp。
注1:脱细胞基质的残留DNA通常是片段化的,并以不同的大小出现,这对细胞外基质脱细胞过程的风险评估可能
具有一定的意义。
注2:可以采用其他经过验证的方法(如全自动毛细管电泳仪)进行DNA片段分析。
6.4 DNA含量测定(荧光染色法)
DNA含量测定步骤如下。
a) 使用6.2.2中k)的纯化DNA样品进行DNA含量测定。
b) DNA标准曲线样品的准备:用1×TE缓冲液将DNA标准品配成2μg/mL的溶液。在光径
1cm 的比色皿中,测定DNA在260nm的光吸收值,对标准品来说,当浓度为2μg/mL时,
A260的OD值为0.04。用1×TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、
5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的标准品溶液各400μL。取稀释好的
标准品溶液每孔125μL加入96孔黑色酶标板内,每份样品设3个复孔。
c) 待测样品的准备:取纯化加标回收试验DNA纯化样品和供试品DNA纯化样品,加入1×TE
缓冲液进行适当的稀释,得到稀释液400μL,取每孔125μL加入到96孔黑色酶标板内,每份
样品设3个复孔。
注:加标回收试验DNA纯化样品和供试品DNA纯化样品的稀释倍数可以调整,宜尽可能保证其反应后荧
光强度值在标准品溶液反应后荧光强度值范围内(小于80ng/mL反应后荧光强度值)。
d) 分别于上述各样品中添加PicoGreen反应液125μL(与样品等体积混合),振荡混匀后室温避
光反应5min,用荧光酶标仪测定。测定条件:以480nm为激发波长,520nm为发射波长进
行测定,以所得数据作图分析并求得回归方程。以1×TE缓冲液为样品测得的荧光强度值为
本底,测定和记录各测定孔的相对荧光强度值(RFI)。
注1:DNA含量在1.25ng/mL~80ng/mL范围线性较好,供试品DNA含量在该范围内可定量测定;当DNA含量
低于1.25ng/mL时为限量测定,表示为小于1.25ng/mL。
注2:PicoGreen反应液:由PicoGreen原液以1×TE缓冲液稀释200倍配制。
注3:1×TE缓冲液:由20×TE缓冲液以DEPC水稀释20倍稀释配制。
7 结果计算
7.1 数据处理
首先对标准品和待测样品进行5次重复测定,获得相对荧光强度值;取5次测定的相对荧光强度
(RFI)值平均数,并减去本底(只有TE,无DNA时测得的RFI值)。
7.2 标准曲线方程计算
利用标准品测定值(RFI值)为纵坐标(y),添加量(ng/mL)为横坐标(x),绘制标准曲线,获得回归
方程式(1):
x=(y-a)/b (1)
式中:
x---添加量,单位为纳克每毫升(ng/mL);
y---测定值,无单位;
a ---常数;
b ---常数。
7.3 供试品纯化加标回收率计算
将加标回收DNA纯化样品减去供试品DNA纯化样品所测得的RFI值,再代入标准曲线回归方程
的y,求得x,即为加标回收DNA对照品的实测值(ng/mL)。按式(2)计算纯化加标回收率。
R=
CERC×Vreaction×Vtotal
VERC-dilu×MERC ×
100% (2)
式中:
R ---纯化加标回收率,%;
CERC ---加标回收DNA对照品实测值,单位为纳克每毫升(ng/mL);
Vreaction ---测试前的反应体积,单位为毫升(mL);
Vtotal ---纯化样品总量,单位为毫升(mL);
VERC-dilu---检测取样量,单位为毫升(mL);
MERC ---加标回收DNA对照品的添加量,单位为纳克(ng)。
7.4 供试品DNA残留量计算
将供试品DNA纯化样品所测得的RFI值减去本底,再代入标准曲线回归方程的y,求得x,即供
试品的实测值(ng/mL)。按式(3)计算供试品DNA含量。
Mtest=
Ctest×Vreaction×Vtotal
Vtest-dilu×Mtest×R
(3)
式中:
Mtest ---单位质量供试品的DNA含量,单位为纳克每毫克(ng/mg);
Ctest ---供试品DNA实测值,单位为纳克每毫升(ng/mL);
Vreaction ---测试前的反应体积,单位为毫升(mL);
Vtotal ---纯化样品总量,单位为毫升(mL);
Vtest-dilu---检测取样量,单位为毫升(mL);
Mtest ---供试品干重,单位为毫克(mg);
R ---纯化加标回收率,%。
注:液体类样品DNA残留量用ng/mL表示。
8 结果判定
8.1 标准曲线方程的相关系数R2 应大于0.99。
8.2 纯化加标回收率应为70%~130%。
8.3 样品检测值如在标曲范围内,则检测值CV应不大于30%;样品检测值如低于标曲最低浓度,则对
检测值CV不作要求;加标样品检测值CV应不大于30%。
8.4 以供试品单位干重质量(mg)的DNA含量为最终的DNA残留量。液体类样品以单位体积(mL)
的DNA含量计算......
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