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| 标准编号 | GB 4789.34-2016 (GB4789.34-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Bifidobacterium | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 12,131 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 4789.34-2012 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | GB 4789.34-2016: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验
GB 4789.34-2016 英文名称: National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Bifidobacterium
1 范围
本标准规定了双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定及计数方法。
本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种
鉴定。本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌
菌种。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃。
2.3 天平:感量0.01g。
2.4 无菌试管:
2.5 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及
配套吸头。
2.6 无菌培养皿:直径90mm。
3 培养基和试剂
3.1 双歧杆菌培养基:见A.1。
3.2 PYG培养基:见A.2。
3.3 MRS培养基:见A.3。
3.4 甲醇:分析纯。
3.5 三氯甲烷:分析纯。
3.6 硫酸:分析纯。
3.7 冰乙酸:分析纯。
3.8 乳酸:分析纯。
4 检验程序
双歧杆菌的检验程序见图1。
图1 双歧杆菌的检验程序
5 操作步骤
5.1 无菌要求
全部操作过程均应遵循无菌操作程序。
5.2 双歧杆菌的鉴定
5.2.1 纯菌菌种
5.2.1.1 样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板。固体菌种或
真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉。
5.2.1.2 接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至
72h±2h。
5.2.2 食品样品
5.2.2.1 样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于
8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的
样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的
条件解冻,时间不超过15min。
5.2.2.2 接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板,或取0.1mL适当
稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,
可延长至72h±2h。
5.2.2.3 纯培养:挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板。36℃±
1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。
5.2.3 菌种鉴定
5.2.3.1 涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或 MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌
为革兰氏染色阳性,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无
动力。
5.2.3.2 生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或 MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测。
过氧化氢酶试验为阴性。双歧杆菌的主要生化反应见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统。
5.2.3.3 有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B。
5.3 双歧杆菌的计数
5.3.1 纯菌菌种
5.3.1.1 固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取2.0g样品,置于盛有198.0mL稀释液的无菌均质
杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有198.0mL稀释液的无菌均质袋中,用
拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶100的样品匀液。
5.3.1.2 液体样品的制备:以无菌操作量取1.0mL样品,置于9.0mL稀释液中,混匀,制成1∶10的样
品匀液。
5.3.2 食品样品
5.3.2.1 样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于
8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的
样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的
条件解冻,时间不超过15min。
5.3.3 系列稀释及培养
用1mL无菌吸管或微量移液器,制备10倍系列稀释样品匀液,于8000r/min~10000r/min均
质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min。每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管
或吸头。根据对样品浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸
取1.0mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1.0mL空白稀释液加入
两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL~20mL冷却至46℃的双歧杆菌琼脂培养基或 MRS琼
脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。从样品稀释
到平板倾注要求在15min内完成。待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延
长至72h±2h。培养后计数平板上的所有菌落数。
5.3.4 菌落计数
5.3.4.1 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以
菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
5.3.4.2 选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU
的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的
平均数。
5.3.4.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到......
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