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| 标准编号 | YY/T 1849-2022 (YY/T1849-2022) | | 中文名称 | | | 英文名称 | Recombinant collagen protein | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C30 | | 字数估计 | 18,188 | | 发布机构 | 国家药品监督管理局 | YY/T 1849-2022: 重组胶原蛋白
ICS 11.040.30
CCSC30
中华人民共和国医药行业标准
重组胶原蛋白
2022-01-13发布
2022-08-01实施
国家药品监督管理局 发 布
目次
前言 Ⅰ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 质量控制 2
4.1 通则 2
4.2 制备工艺的质量控制 2
4.3 重组胶原蛋白的质量控制 2
5 检测项目、要求和检测方法 2
5.1 通则 2
5.2 理化项目 3
5.3 鉴别 4
5.4 纯度 4
5.5 杂质、污染物和添加剂 5
5.6 含量 6
5.7 结构表征 6
5.8 生物学功能 7
5.9 安全性试验 8
6 稳定性 9
7 生物学评价 9
8 包装、运输和贮存 9
附录A(资料性) 重组胶原蛋白特性分析 10
附录B(规范性) 细胞黏附性测定---离心法 12
附录C(规范性) 细胞移行试验---细胞划痕法 14
参考文献 15
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由国家药品监督管理局提出。
本文件由中国食品药品检定研究院归口。
本文件起草单位:中国食品药品检定研究院、四川省药品检验研究院(四川省医疗器械检测中心)、
山东省医疗器械和药品包装检验研究院、北京大学口腔医学院口腔医疗器械检验中心、陕西巨子生物技
术有限公司、山西锦波生物医药股份有限公司、江苏创健医疗科技有限公司、江苏江山聚源生物技术有
限公司。
本文件主要起草人:陈亮、刘兴兰、侯丽、韩建民、徐丽明、段志广、李海航、王建、赵健烽、赵代国、
王鸾鸾、王觉晓、范行良、吴洋、蒋若丹、兰婉玲、盖潇潇、严建亚、孙丹丹、田旭栋、黄建民。
重组胶原蛋白
1 范围
本文件规定了重组胶原蛋白的质量控制要求、检测指标及其检测方法等。
本文件适用于作为医疗器械原材料的重组胶原蛋白的质量控制。
注:鉴于目前的技术研发现状,本文件中的重组胶原蛋白主要指基于人的胶原蛋白基因重组的产物。基于非人胶
原蛋白基因的重组胶原蛋白或类胶原蛋白产物可参考本文件,但需要根据具体的产品特性和生产工艺进行质
量控制。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 16886.1 医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验
GB/T 16886.20 医疗器械生物学评价 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则和方法
GB 18278.1 医疗保健产品灭菌 湿热 第1部分:医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制
要求
GB 18279.1 医疗保健产品灭菌 环氧乙烷 第1部分:医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控
制的要求
GB 18280.1 医疗保健产品灭菌 辐射 第1部分:医疗器械灭菌过程的开发、确认和常规控制
要求
YY/T 1453 组织工程医疗器械产品 Ⅰ型胶原蛋白表征方法
YY/T 1465(所有部分) 医疗器械免疫原性评价方法
YY/T 1805.2 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第2部分:Ⅰ型胶原蛋白分子量检测 十二
烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法
YY/T 1805.3 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第3部分:基于特征多肽测定的胶原蛋白含
量检测 液相色谱-质谱法
中华人民共和国药典
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
胶原蛋白 colagen
胶原
一类含有至少20种在遗传学上不同类型的分泌蛋白质家族,主要担任机体的结构支撑功能,具有
独特的由三条多肽链(被称为α链)组成的三螺旋构型,并具有一定的生物学功能。
3.2
采用重组DNA技术,对编码所需人胶原蛋白质的基因进行遗传操作和(或)修饰,利用质粒或病毒
载体将目的基因带入适当的宿主细胞(细菌、酵母或其他真核细胞等)中,表达并翻译成胶原蛋白(3.1)
或类似胶原蛋白(3.1)的多肽,经过提取和纯化等步骤制备而成。
4 质量控制
4.1 通则
由于重组基因片段的型别与序列的不同,表达体系的差异,致使获得的产物不尽相同,与天然胶原
蛋白相比,氨基酸组成、分子量大小和(或)结构可能差异很大,甚至是个全新的蛋白质。因此,宜对其进
行全面的特性分析(见附录A),进行严格的质量控制。
重组胶原蛋白的质量控制与分子量大小、结构特性、质量属性复杂程度以及生产工艺相关。质量控
制体系主要包括原辅料质量控制、生产工艺和过程控制及最终成品的检测等。应通过成品检测、过程控
制和工艺验证相结合的方法,确保各类杂质已去除或降低至可接受水平。
4.2 制备工艺的质量控制
重组胶原蛋白属于一种重组蛋白,应参照《中华人民共和国药典》“人用重组DNA蛋白制品总论”
中“制造”的所有要求,包括:基本要求、工程细胞(细菌、酵母或其他真核细胞等)的控制(表达载体和宿
主细胞、细胞库系统、细胞库的质量控制、细胞基质的遗传稳定性)、生产过程的控制(细胞培养、提取和
纯化、原液、半成品和成品)和生产工艺变更要求,建立质量控制体系。不适用条款或事项需给出合理的
说明。
4.3 重组胶原蛋白的质量控制
重组胶原蛋白成品的质量控制包括采用参比品和经验证的方法评估已知和(或)潜在的成品相关物
质和工艺相关物质,以及采用适宜的方法对成品鉴别、生物学功能、纯度和杂质等进行检测和分析。
选择已证明足够稳定且适合临床试验的一个(多个)批次,或用一个代表批次作为参比品,用于鉴
别、理化和生物学功能等各种分析。根据重组DNA蛋白制品特性,应对参比品做全面深入的表征/特
性分析。参比品的建立和制备应参照《中华人民共和国药典》“生物制品国家标准物质制备和标定”的相
关要求。
用于理化测定等方面的参比品,如用于肽图或等电点测定的参比品,可用原液直接分装制备,一般
-70℃以下或经验证的贮存条件下保存。根据重组DNA蛋白制品特性,参比品应进行必要的分析鉴
定,包括:蛋白质含量、等电点、纯度、N端氨基酸序列、分子量、肽图、指纹肽图谱库、二硫键分析及糖基
分析(酵母或其他真核细胞表达)等。
5 检测项目、要求和检测方法
5.1 通则
收获液经提取、纯化分装于中间贮存容器中即为原液。原液的检验项目取决于工艺的验证、一致性
的确认和预期成品相关杂质与工艺相关杂质的水平。应采取适当方法对原液质量进行检测,必要时应
与参比品进行比较。经工艺验证后,可由一批或多批原液合并生产半成品,制成成品前,如需对原液进
行稀释或加入其他辅料制成半成品,应确定半成品的质量控制要求,包括检测项目和可接受标准。
根据具体重组胶原蛋白成品的特性确定需要进行的特性分析检测项目。建立或验证重组胶原蛋白
生产过程的有效性或可接受性的特性分析检测项目可不纳入常规质量控制中,但应对某一特定质量属
性是否放入常规放行标准予以说明。常规质量控制的检测项目包括如下几个方面。
5.2 理化项目
5.2.1 外观(如性状、颜色)
肉眼直接观测,供试品应为白色/淡黄色/无色透明液体或凝胶,或白色/类白色冻干粉或海绵状
固体。
5.2.2 可见异物
适用时,按照《中华人民共和国药典》“可见异物检查法”的“灯检法”进行检测,供试品应无明显
异物。
5.2.3 溶解性
应根据供试品的溶解特性,对供试品在水、稀酸或中性盐溶液中的溶解程度进行表征和阐述。
5.2.4 水分
取供试品约1g~2g,按照《中华人民共和国药典》“水分测定法”第二法(烘干法)测定,或取供试品
约10mg按照《中华人民共和国药典》“热分析法”热重法(TG)测定,升温程序:从室温以10℃/min速
率升温至105℃,保持60min。减失重量应符合所标示范围。规定仲裁方法为水分测定法。
5.2.5 炽灼残渣
按照《中华人民共和国药典》“炽灼残渣检查法”测定,供试品应符合所标示范围。
5.2.6 pH值
用0.9%氯化钠溶液将供试品制成1mg/mL的溶液,若使用其他溶剂溶解应明确说明使用溶剂及
浓度,按照《中华人民共和国药典》“pH值测定法”测定,应符合所标示范围。
5.2.7 渗透压摩尔浓度
如适用,用0.9%氯化钠溶液将供试品制成1mg/mL的溶液或根据临床预期使用,将供试品配制
成相应溶液,按照《中华人民共和国药典》“渗透压摩尔浓度测定法”测定,应符合所标示范围。
5.2.8 动力黏度
取供试品按照《中华人民共和国药典》“黏度测定法”的“旋转黏度计测定法”测定,需要详细描述试
验条件,动力黏度值应符合所标示范围。
注:对于重组胶原蛋白凝胶,宜测定动力黏度。
5.2.9 热稳定性
5.2.9.1 采用差示扫描量热法(DSC)进行解聚温度分析。按照《中华人民共和国药典》“热分析法”进
行。初始温度20℃,以2℃/min速度升温至200℃,记录热分析曲线。根据供试品的通常贮存性状
(如冻干粉等)和预期使用性状进行相同或相似样品条件下的差示扫描量热分析。
注:水不溶性重组胶原蛋白的热稳定性测定宜采用差示扫描量热法(DSC)进行。
5.2.9.2 将供试品原液,或重组胶原蛋白冻干粉或海绵加水制成10mg/mL的溶液,置(57±0.5)℃水
浴中保温4h后,用可见异物检查装置,肉眼观察应无凝胶化或絮状物。
5.2.10 装量及其差异
按照《中华人民共和国药典》“最低装量检查法”,根据供试品性状(溶液、凝胶、冻干海绵或冻干粉末
等)和装量的不同确定装量的允差要求。
5.3 鉴别
5.3.1 肽图
5.3.1.1 按照《中华人民共和国药典》“肽图检查法”的第一法“胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法”进
行测定,应与参比品肽图一致,主要特征肽段相对比例(响应强度)应与参比品基本一致。
注:如胰蛋白酶不能水解,选择适宜的其他蛋白酶。
5.3.1.2 按照《中华人民共和国药典》“质谱法”进行测定,采用适宜的质谱技术对各色谱峰对应的肽段
进行定性,序列覆盖率应符合所标示范围。
注:如胰蛋白酶不能水解,选择适宜的其他蛋白酶。
5.3.2 末端氨基酸序列
用氨基酸序列分析仪或质谱法测定N端和/或C端氨基酸序列,其结果应符合理论预测(每年应至
少做一次)。
5.3.3 分子量
5.3.3.1 按照YY/T 1805.2规定的方法条件进行试验,分子量应符合标示要求。
5.3.3.2 按照《中华人民共和国药典》“高效液相色谱法”进行分子量分析时,出峰保留时间应与定性参
比品(经过飞行时间质谱鉴定过的重组胶原蛋白)保持一致。
5.3.3.3 按照《中华人民共和国药典》“质谱法”进行测定,其分子量应与理论分子量一致。
5.3.4 等电点
按照《中华人民共和国药典》“电泳法”的“等电聚焦电泳法”或“毛细管电泳法”测定,其等电点应在
标示范围内。
5.4 纯度
5.4.1 电泳法
按照《中华人民共和国药典》“电泳法”的 非还原型“SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳法”测定,分离胶的胶
浓度为15%,供试品加水制成浓度为1mg/mL~2mg/mL的溶液,点样量10μL,考马斯亮蓝R250染
色,经扫描仪扫描,纯度应符合标示要求。
5.4.2 高效液相色谱法
按照《中华人民共和国药典》“色谱法”的“分子排阻色谱法”测定,按面积归一化法计算纯度,其结果
应符合标示要求。
注1:适用时,可采用反相高效液相色谱法。
注2:适用时,可采用样品图谱与参比品一致,或主峰保留时间与参比品主峰保留时间一致进行判断。
5.5 杂质、污染物和添加剂
5.5.1 总则
按照《中华人民共和国药典》“人用重组DNA蛋白制品总论”对“纯度和杂质”的要求,工艺相关杂
质的质量控制(如蛋白质A、宿主细胞蛋白质、DNA、其他潜在的培养或纯化残留物等)通常在原液阶段
进行。如经充分验证证明生产工艺对工艺相关杂质的去除已达到高水平时,工艺相关杂质的质量控制
可在恰当工艺步骤的中间产物进行,可不列入放行检测中。杂质检测项目可能涉及,但不限于如下
项目。
5.5.2 外源性DNA残留量
按照《中华人民共和国药典》“外源性DNA残留量测定法”的“荧光染色法”或“定量PCR法”进行
测定,“荧光染色法”的样品加标回收率应满足70%~130%;“定量PCR法”的样品加标回收率应满足
50%~150%,应规定残留限量。如果样品中外源性DNA残留量低于“荧光染色法”的检测限,则应采
用“定量PCR法”进行测定。
注1:宜根据预期临床用途(作为植入物体内使用,还是作为敷料等体表、黏膜使用)、使用量等,确定含重组胶原蛋
白的产品临床最大使用量的外源性DNA残留量限值。如果含重组胶原蛋白的产品预期为体内植入剂,推荐
参考生物制品外源性DNA残留限量要求,结合残留DNA宿主类型及其风险程度设定每人每次最大使用量
限值。
注2:生物制品中大肠杆菌或酵母菌表达的基因工程重组产品外源性 DNA残留量,如:注射用人生长激素≤
1.5ng/mg,或注射用人干扰素≤10ng/剂;CHO细胞表达的基因工程重组产品(如人促红素)外源性DNA残
留量≤100pg/剂(10000IU);重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)≤10pg/剂。
5.5.3 大肠杆菌蛋白质残留量
按照《中华人民共和国药典》“大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试剂
盒进行测定,其结果应在总蛋白的0.05%以下(体内植入),或0.1%以下(外用)。
5.5.4 酵母蛋白质残留量
按照《中华人民共和国药典》“酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法”或采用经验证的酶联免疫试
剂盒进行测定,其结果应在总蛋白的0.05%以下(体内植入),或0.1%以下(外用)。
5.5.5 CHO细胞蛋白质残留量
采用经验证的酶联免疫试剂盒进行测定,CHO细胞蛋白质残留量应在总蛋白的0.05%以下(体内
植入),或0.1%以下(外用)。
5.5.6 残余抗生素含量/活性
应根据工艺中采用的表达体系和使用的抗生素类型,采用经验证的方法测定残余抗生素含量/活
性,并根据风险分析规定可接受的限量要求。不应有残余抗生素活性。
残余抗生素活性按照《中华人民共和国药典》“抗生素残留量检查法(培养法)”进行试验。
残余抗生素含量可按照《中华人民共和国药典》“免疫化学法”的“酶联免疫吸附法”进行试验。其
中,氨苄西林残留量也可采用高效液相色谱-质谱法。推荐液相色谱条件可采用十八烷基硅烷键合硅胶
为填充剂,流动相A为水(甲酸0.1%),流动相B为乙腈(甲酸0.1%)梯度洗脱;质谱采用电喷雾电离离
子源(ESI)为离子源。
注:根据风险分析规定可接受的限量要求。如疫苗抗生素残留规定≤50ng/剂。
5.5.7 促炎性污染物(肽聚糖等)
采用经验证的方法或经验证的市售细菌肽聚糖检测试剂盒(ELISA)检测残留肽聚糖,应根据其致
热反应风险规定可接受的限量要求。
5.5.8 重金属及微量元素含量
5.5.8.1 对工艺中添加的重金属元素,应按照《中华人民共和国药典》“原子吸收分光光度法”,或“电感
耦合等离子体质谱法”进行测定,其结果应符合标示的限量要求。
5.5.8.2 残留重金属总量按照《中华人民共和国药典》“重金属检查法”检测,重金属总量(以Pb计)应
≤10μg/g(质量分数)。
5.5.8.3 残留金属元素按照《中华人民共和国药典》“原子吸收分光光度法”“电感耦合等离子体质谱法”
或相当的方法进行测定(应进行方法学确认和验证),其结果应符合限量要求:砷(As)≤1μg/g,汞(Hg)
≤4μg/g,铅(Pb)≤15μg/g,铬(Cr)、镉(Cd)≤50μg/g(质量分数)。预期植入用的重组胶原蛋白成品
中铜(Cu)、钼(Mo)、铁(Fe)、镍(Ni)均≤50μg/g(质量分数)。
5.5.9 添加剂
如果使用了防腐剂、冻干保护剂等添加剂,应给出其限量要求和检测方法。
5.6 含量
5.6.1 重组胶原蛋白含量用总蛋白含量和纯度计算。总蛋白含量的测定按照《中华人民共和国药典》
“蛋白质含量测定法”的“凯氏定氮法”进行测定,纯度按5.4进行检测。含量结果应在标示量的
90%~110%。
注:关于凯氏定氮法计算蛋白含量时的系数,需要根据理论氨基酸序列和异质性状态的测算和验证予以确定。
如果是液体或凝胶状样品,以重组胶原蛋白含量除以样品总体积,即可得到相对于单位体积样品中
重组胶原蛋白的相对含量数据,标示为 mg/mL;如果为固体样品或冻干品,以重组胶原蛋白含量除以
总质量,即可得到单位质量样品中重组胶原蛋白的相对含量数据,标示为mg/mg。
5.6.2 特征多肽法:用高效液相色谱-质谱法进行特异性特征多肽的定量检测,得到重组胶原蛋白特征
多肽含量。基于特异性特征多肽的高效液相色谱-质谱方法按照YY/T 1805.3的规定进行。
5.7 结构表征
5.7.1 异质性分析
如适用,应充分表征重组胶原蛋白的各种异质性(如脱酰胺化、氧化、异构化、碎片化、二硫键错配、
N-连接和O-连接的寡糖、糖基化、聚集等)。可使用高分辨率色谱质谱技术(如:LCMS-QTOF)对样品
适宜的蛋白质酶(如:胰蛋白酶)酶解产物进行肽图指纹图谱分析,通过将天冬酰胺脱酰胺化和甲硫氨酸
氧化修饰设置为可变修饰,分析多见的脱酰胺化和氧化异质性。应通过适合的理化方法分析高级结构,
并通过生物学功能进行确证,也可采用体外或体内证实其发挥功能或作用的分析方法,作为高级结构确
证的补充。
5.7.2 一级结构的表征
应采用氨基酸序列分析仪或质谱法进行氨基酸序列分析。其结果应符合理论序列。
5.7.3 红外光谱
每种重组胶原蛋白都有其特征的红外光谱,供试品的红外光谱图应与参比品一致。光谱图应规定
非特征区(如:酰胺A、B)和特征区(如:酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ)的特征峰位置。
5.7.4 圆二色(CD)光谱
胶原的CD谱图在195nm附近的波长处有负峰,在221nm附近的波长处有正峰。如果检测不到
在221nm附近处的正峰,则提示没有三螺旋结构。如果定性检测证实供试品中有三螺旋结构,则可利
用不同比例的系列胶原蛋白对照品和其完全变性的胶原蛋白对照品混合物作为外标法对照品,与在
221nm附近波长处的正峰强度进行拟合,实现三螺旋含量的相对定量分析。推荐使用组织提取胶原蛋
白国家医药标准物质作为对照品。
5.7.5 微量差热分析(DSC)
胶原蛋白的三螺旋结构的特征表现出特定的吸收峰,如组织提取牛Ⅰ型胶原蛋白在(43±1)℃有吸
收峰,如果检测不到特征峰则提示供试品中没有三螺旋结构。如果定性检测已证实供试品含有三螺旋
结构,则可利用不同比例的系列胶原蛋白对照品和其完全变性的胶原蛋白对照品混合物作为外标法对
照品,对三螺旋含量进行相对定量分析。推荐使用组织提取胶原蛋白国家医药标准物质作为对照品。
5.7.6 蛋白酶敏感性分析
如适用,可用胰蛋白酶、胃蛋白酶或其他蛋白酶敏感性试验,提示有无三螺旋结构,及检测没有螺旋
结构的单链含量,间接获得三螺旋结构的含量比。通过加热变性处理和非加热变性处理样品的蛋白酶
酶解产物中特征多肽含量的比较分析,如果二者特征多肽检测的响应强度(谱峰高度或面积)一致,则提
示无三螺旋结构;如果加热变性处理后样品的响应强度明显高于非加热变性处理样品,则提示可能含有
三螺旋结构。
如果重组胶原蛋白中存在三螺旋结构,应选择2种或2种以上方法进行充分的表征和确证。推荐
使用组织提取胶原蛋白对照品进行对比分析。
5.7.7 脯氨酸羟基化分析
如适用,应进行脯氨酸羟基化分析,按照YY/T 1453规定的方法,使用氨基酸分析仪定量检测羟脯
氨酸含量,其结果应符合标示值。
5.7.8 糖谱/糖基化修饰分析
如适用,应进行糖谱/糖基化修饰分析,参照《中华人民共和国药典》“单抗 N糖谱测定法”进行测
定,供试品测定结果应在规定的范围内。必要时应将供试品与参比品进行比较。
5.8 生物学功能
5.8.1 通则
重组胶原蛋白的生物学功能是指以重组胶原蛋白生物学特性相关属性为基础的生物学作用,对声
称的生物学功能宜进行定性/定量分析。
胶原是细胞外基质的主要成分。重组胶原蛋白的主要生物学功能是为细胞提供支架和良好的微环
境,如促进细胞黏附、增殖生长、分化等。因此,可通过评价细胞-胶原蛋白相互作用来评价重组胶原蛋
白的生物学功能。
注1:在生物学性能评价试验中,如果重组胶原蛋白是溶于酸性溶液中形成pH值呈酸性的黏稠状液体,需对其可
溶性和pH值进行调节,在不影响重组胶原蛋白结构与功能特性的前提下,采用适宜的方式制备供试样品。
注2:如果产品以非无菌的方式提供,可将样品除菌后用于细胞试验,宜考虑除菌方式对重组胶原蛋白生物学功能
的影响。
5.8.2 细胞增殖
用重组胶原蛋白包被细胞培养板或其他经验证的方法,采用合适的预期临床应用时可能接触的细
胞(如皮肤成纤维细胞),接种密度在50%左右,常规培养2天~3天后检测细胞增殖情况,考察重组胶
原蛋白包被梯度浓度的剂量-效应关系......
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