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| 标准编号 | GB 5009.213-2016 (GB5009.213-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定 | | 英文名称 | Determination of paralytic shellfish poison in shellfish | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 67.040 | | 字数估计 | 26,280 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 23215-2008; GB/T 5009.213-2008; SC/T 3023-2004; SN 0352-1995; SN/T 1735-2006; SN/T 1773-2006 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | | 范围 | 本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素测定的小鼠生物法，酶联免疫吸附方法，液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。本标准适用于牡砺、扇贝等贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的检测。 | GB 5009.213-2016: 食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定
GB 5009.213-2016 英文名称: Determination of paralytic shellfish poison in shellfish
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
食品安全国家标准
贝类中麻痹性贝类毒素的测定
1 范围
本标准规定了贝类中麻痹性贝类毒素测定的小鼠生物法,酶联免疫吸附方法,液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。
本标准适用于牡蛎、扇贝等贝类及其制品中麻痹性贝类毒素的检测。
2 原理
用盐酸提取贝类中麻痹性贝类毒素(PSP)。记录小鼠腹腔注射提取液后的死亡时间,根据麻痹性
贝类毒素致小鼠死亡时间与鼠单位关系的对照表查出鼠单位(MU),并按小鼠体重对鼠单位进行校正
得到校正鼠单位(CMU),计算得到每100g样品中PSP的鼠单位。以石房蛤毒素作为标准,将鼠单位
换算成毒素的微克数,计算每100g贝肉中的PSP微克数。测定结果代表存在于贝肉内各种化学结构的PSP毒素总量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.2 盐酸(HCl)。
3.1.3 无水乙醇(CH3CH2OH)。
3.2 试剂配制
3.2.1 氢氧化钠溶液(0.1mol/L):将4.0g氢氧化钠溶于1L水中。
3.2.2 盐酸溶液(0.18mol/L):将15.5mL盐酸用蒸馏水稀释至1L。
3.2.3 盐酸溶液(5mol/L):将45mL盐酸用水稀释至100mL。
3.2.4 酸性乙醇溶液:量取无水乙醇200mL,用水稀释至1000mL,混匀,用盐酸溶液(5mol/L)调节pH至2.0~4.0。
3.3 标准品
石房蛤毒素标准品(STX,C10H17N7O4·2HCl,CAS号35554-08-6):纯度≥98.0%。
3.4 标准溶液的配制
3.4.1 石房蛤毒素标准储备液(100μg/mL):准确称取适量STX标准品,用酸性乙醇溶液溶解并定容,
配制成STX的质量浓度为100μg/mL的标准储备液。
3.4.2 石房蛤毒素标准工作液(1μg/mL):准确吸取1mL石房蛤毒素标准储备液(100μg/mL),用水
稀释,用盐酸溶液(5mol/L)调节pH至2.0~4.0,用水定容至100mL。该标准工作液于0℃~4℃下可保存30d。
3.5 材料
3.5.1 小鼠:体重为19g~21g的健康ICR系雄性小鼠。
3.5.2 pH计或pH试纸。
4 仪器和设备
4.1 均质器。
4.2 分析天平:感量为0.1g和0.0001g。
4.3 离心机:转速≥2000r/min。
5 分析步骤
注:为避免毒素的危害,应戴手套进行操作。移液管及移液器吸头等用过的器材、废弃的提取液等应在次氯酸钠溶
液(5%)中浸泡1h以上以使毒素分解。对于动物实验过程中产生的污水、废弃物及动物尸体处理,应参照
GB 14925执行。
5.1 样品采集
从2kg以上样品中采取足够贝类个数,去壳使贝肉达200g以上。不能及时送检的新鲜贝类,开
壳将贝肉分离,将沥水后的200g贝肉放入200mL盐酸溶液(0.18mol/L)中,置4℃保存,备检。
5.2 试样制备
5.2.1 牡蛎、蛤及贻贝
用清水将贝类样品外表彻底洗净,切断闭壳肌,开壳,用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他异物。将
闭壳肌和连接在胶合部的组织分开,仔细取出贝肉,切勿割破贝体。严禁加热或用麻醉剂开壳。收集约
200g贝肉分散置于筛子中沥水5min(不要使肉堆积),捡出碎壳等杂物,将贝肉均质备用。
5.2.2 扇贝
取可食部分用作检测,按5.2.1均质后备用。
5.2.3 冷冻贝类
在室温下,使冷冻的样品(带壳或脱壳的)自然融化,按5.2.1开壳、淋洗、取肉、均质、备用。
5.2.4 贝类罐头
将罐内所有内容物(肉及液体)充分均质。如果是大罐,将贝肉沥水并收集沥下的液体分别称重并
存放固形物和汤汁,将固形物和汤汁按原罐装比例混合,均质后备用。
5.2.5 用酸保存的贝肉
沥去酸液,分别存放贝肉及酸液,备用。
5.2.6 贝肉干制品
干制品可于等体积盐酸溶液(0.18mol/L)中浸泡24h~48h(4℃冷藏),沥去酸液,分别存放贝肉及酸液备用。
5.3 PSP标准品对照试验
5.3.1 PSP标准工作液的配制
用10mL、15mL、20mL、25mL和30mL水分别稀释10mL石房蛤毒素标准工作液,配制成系列浓度的标准稀释液。
5.3.2 中位数死亡时间的PSP标准工作液选择
取按5.3.1配制的系列浓度的标准稀释液各1mL,腹腔注射小鼠数只,选择中位数死亡时间为
5min~7min的浓度剂量。如某浓度稀释液已达到要求,还需以1mL水的增减量进行补充稀释试验。
每只小鼠试验前称重,以10只小鼠为一组,用中位数死亡时间在5min~7min范围内的两个浓度
的标准稀释液注射小鼠,测定并记录每只小鼠腹腔注射完毕至停止呼吸的所需死亡时间。
5.3.3 毒素转换系数(CF)的计算
5.3.3.1 小鼠中位数死亡时间的选择
计算5.3.2中所选择浓度的标准稀释液受试组的中位数死亡时间。弃去中位数死亡时间小于
5min或大于7min的受试组;选择中位数死亡时间在5min~7min的受试组,该受试组中可允许有个
别小鼠的死亡时间可小于5min或大于7min。
5.3.3.2 校正鼠单位(CMU)的计算
对于所选定的中位数死亡时间为5min~7min的受试组,根据附录A查得该组中每只小鼠死亡时
间所对应的鼠单位(MU),再根据附录B查得组中每只小鼠体重所对应的体重校正系数,同一只小鼠的
体重校正系数与鼠单位相乘得到该只受试小鼠的校正鼠单位(CMU)。
5.3.3.3 毒素转换系数(CF)的计算
单只小鼠的毒素转换系数(CF)按式(1)计算:
5.3.3.4 组间毒素转换系数(CF2)的计算
取不同受试组的组内毒素转换系数的平均值,即为组间毒素转换系数(CF2)。
以组间毒素转换系数进行试样毒力的计算。
5.3.3.5 CF值定期检查
如PSP检测间隔时间较长,每次测定时要用适当的标准稀释液注射5只小鼠,重新测定CF值。如
果一周有几次检测,则用中位数死亡时间5min~7min的标准稀释液每周检查一次,测得的CF值应在
原测定CF值的±20%范围内。若结果不符,则用同样的标准稀释液另外注射5只小鼠,综合之前注射
的5只小鼠的结果,计算出CF值。并用同样的标准稀释液注射第二组10只小鼠,将第二组求出的CF
值和第一组的CF值进行平均,即为一个新的CF值。
重复检查的CF值通常在原结果的±20%之内,若经常发现有较大偏差,在进行常规检测前应调查
该方法中是否存在可变影响因素。
5.4 试样提取
取100g试样于烧杯中,加盐酸溶液(0.18mol/L)100mL充分搅拌,均质,调节pH至2.0~4.0,必
要时,可逐滴加入盐酸溶液(5mol/L)或氢氧化钠溶液(0.1mol/L)调节pH,加碱时速度要慢,同时需不
断搅拌,防止局部碱化破坏毒素。将混合物加热煮沸5min,冷却至室温,移至量筒中并稀释至200mL,
调节pH至2.0~4.0。
将混合物倒回烧杯,搅拌均匀,自然沉降至上清液呈半透明状,不堵塞注射针头即可,必要时将混合
物或上清液以3000r/min离心5min,或用滤纸过滤。收集上清液备用。
5.5 小鼠试验
取19.0g~21.0g健康ICR雄性小鼠6只,称重并记录重量。随机分为实验组和空白对照组两组,每组3只。
对每只实验组小鼠腹腔注射1mL试样提取液,对每只空白对照组腹腔注射1mL盐酸溶液
(0.18mol/L)。注射过程中若有一滴以上提取液溢出,须将该只小鼠丢弃,并重新注射一只小鼠。记录
注射完毕时间,仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止)。
若注射试样提取液后,1只或2只小鼠的死亡时间大于7min,需再注射至少三只小鼠。
若小鼠的死亡时间小于5min,稀释试样提取液后,再注射3只小鼠,直至小鼠在5min~7min内
死亡;稀释试样提取液时,需逐滴加入盐酸溶液(0.18mol/L)调节pH至2.0~4.0。
6.1.2 以质量分数计的PSP毒力的结果表述
若空白对照组小鼠正常,则报告待测样品中PSP毒素含量为
Y ---每100g样品的 MU值,单位为鼠单位每百克(MU/100g);
CMU1---实验组小鼠的中位数校正鼠毒力单位;
DF ---稀释倍数;
200 ---试样提取液的体积,单位为毫升(mL)。
注:对于取得PSP标准品有困难的实验室,可按式(3)计算以 MU计的PSP毒力。
6.2.2 以 MU计的PSP毒力的判断与结果表述
在空白对照组小鼠正常的情况下进行如下判断和表述:
若实验组中位数死亡时间小于5min,则应对样品提取液进行稀释,再选取3只小鼠进行试验,直
至得到中位数死亡时间为5min~7min为止,根据最后的稀释液实验结果计算样品的鼠单位毒力,报
告该样品的鼠单位毒力为:××× MU/100g。
若实验组中位数死亡时间大于7min,则直接计算确定样品鼠单位毒力,
报告该样品的鼠单位毒力为:××× MU/100g。
若实验组中所有小鼠在观察15min内均不死亡,可报告该样品的鼠单位毒力小于400MU/100g。
7 原理
游离麻痹性贝类毒素与其酶标记物竞争麻痹性贝类毒素抗体,同时麻痹性贝类毒素抗体与捕捉抗
体连接。没有被结合的酶标记物在洗涤步骤中被除去。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的
产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。用酶标仪在450nm波长下测量微孔溶液的吸光度
值,试样中麻痹性贝类毒素含量与吸光度值成反比,按绘制的标准曲线定量计算。
8 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
8.1 试剂
8.1.1 盐酸(HCl)。
8.1.2 十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)。
8.1.3 氯化钠(NaCl)。
8.1.4 氯化钾(KCl)。
8.1.5 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
8.1.6 吐温-20(C58H114O26)。
8.1.7 牛血清白蛋白(BSA)。
8.1.8 酶标记物。
8.1.9 麻痹性贝类毒素抗体。
8.1.10 过氧化氢(H2O2)。
8.1.11 3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB,C16H20N2)。
8.1.12 硫酸(H2SO4)。
8.2 试剂配制
8.2.1 盐酸溶液(0.1mol/L):量取9mL盐酸,用水稀释至1000mL。
8.2.2 盐酸溶液(5mol/L):量取450mL盐酸,用水稀释至1000mL。
8.2.3 磷酸盐缓冲液(PBS溶液,pH7.4):分别称取磷酸二氢钾0.20g、十二水合磷酸氢二钠2.90g、氯
化钠8.00g、氯化钾0.20g,加水溶解并定容至1000mL。
8.2.4 抗体稀释液:称取1.0gBSA,加PBS溶液溶解并定容至1000mL。
8.2.5 酶标记物工作液:用抗体稀释液将酶标记物稀释至工作浓度。
8.2.6 麻痹性贝类毒素抗体工作液:麻痹性贝类毒素抗体用抗体稀释液稀释至工作浓度。
8.2.7 洗脱液:吸取0.5mL吐温-20,用PBS溶液稀释至1000mL。
8.2.8 硫酸溶液(1mol/L):吸取53.2mL硫酸,缓缓加至盛有500mL水的烧杯中,并用水定容至1000mL,混匀。
8.3 标准品
石房蛤毒素(STX,C10H17N7O4·2HCl,CAS号35554-08-6)标准溶液。
8.4 标准溶液配制
标准系列工作液配制:准确吸取适量体积的石房蛤毒素标准溶液用PBS溶液(pH7.4)稀释,配制
成质量浓度分别为0μg/L,2.5μg/L,5μg/L,10μg/L,20μg/L,40μg/L的标准系列工作液。现用现配。
8.5 材料
包被有麻痹性贝类毒素捕捉抗体的微孔板。
注:商业化试剂盒若评价技术参数达到本标准的要求则也适合于本标准,参见附录C。
9 仪器和设备
9.1 酶标仪。
9.2 均质器。
9.3 离心机:转速≥6000r/min。
10 分析步骤
10.1 样品采集
同5.1。
10.2 试样制备
同5.2。
10.3 试样提取
称取10g(精确至0.1g)试样,加入70mL盐酸溶液(0.1mol/L)[如为较干燥的贝肉,加入140mL
盐酸溶液(0.1mol/L)],煮沸并搅拌5min,4℃条件下6000r/min离心10min,上清液用盐酸溶液
(5mol/L)调节pH至4.0以下。取100μL提取液,加入900μLPBS溶液(pH7.4),混匀,取50μL进行测定。
10.4 测定
将包被有麻痹性贝类毒素捕捉抗体的微孔条插入微孔架并做好标记,其中包括空白对照孔、标准液
孔和样液孔,分别做平行孔。向空白对照孔加入50μL磷酸盐缓冲液,标准液孔加入50μL麻痹性贝类
毒素标准系列工作液,样液孔加入50μL样液。加入50μL麻痹性贝类毒素酶标记物至每个微孔,轻轻
混合;再加入50μL麻痹性贝类毒素抗体至每个微孔,彻底混合,用黏胶纸封住微孔以防溶液挥发,
20℃~25℃ 黑暗避光处孵育15min。孵育结束后,倒去......
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