| 标准编号 | GB 31656.11-2021 (GB31656.11-2021) | | 中文名称 | | | 英文名称 | (National Food Safety Standard Determination of Oxytetracycline, Tetracycline, Chlortetracycline and Doxycycline Residues in Aquatic Products) | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X04 | | 字数估计 | 12,163 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局 | GB 31656.11-2021: 食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定
食品安全国家标准
水产品中土霉素、四环素、金霉素、
多西环素残留量的测定
中华人民共和国国家标准
中华人民共和国国家卫生健康委员会发布
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
中华人民共和国农业农村部
代替 GB/T 22961-2008
１ 范围
本文件规定了水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量测定的高效液相色谱法.
本文件适用于鱼、虾、蟹、鳖及海参等水产品可食组织中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的
测定.
２ 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,
仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本
文件.
GB/T ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T ３０８９１-２０１４ 水产品抽样规范
３ 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
４ 原理
试样中土霉素、四环素、金霉素和多西环素经柠檬酸缓冲溶液提取后,固相萃取柱净化,液相色谱荧光
检测器检测,外标法定量.
５ 试剂与材料
以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯;水为符合GB/T ６６８２规定的一级水.
5.1 试剂
5.1.1 甲醇(CH₃OH):色谱纯。
5.1.2乙酸镁(C₄H₆O₄Mg·4H₂O)。
5.1.3咪唑(C₃H₄N₂)。
5.1.4磷酸二氢钾(KH₂PO)。
5.1.5柠檬酸(C₆H₈O₃·H₂O):优级纯。
5.1.6磷酸氢二钠(Na₂HPO₄):优级纯。
5.1.7乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O):优级纯。
5.1.8冰乙酸(CH₃COOH)。
5.2溶液配制
5.2.1 磷酸二氢钾溶液：取磷酸二氢钾13.6 g,加水适量使溶解并稀释至1000 mL。
5.2.2甲醇溶液：取甲醇5mL、水95mL,混匀。
5.2.3柠檬酸缓冲液：取柠檬酸6.30 g、磷酸氢二钠13.8 g、乙二胺四乙酸二钠1.86 g,加水400 mL使溶解，用冰乙酸调pH至4.0,再用水稀释至500mL。
5.2.4咪唑缓冲溶液：取咪唑68.0g、乙二胺四乙酸二钠0.40g、乙酸镁10.0g,加水800mL使溶解，用
冰乙酸调pH至7.2,再用水稀释至1000mL,经0.45μm水相微孔滤膜过滤后备用。
5.2.5 甲醇-咪唑缓冲溶液：取甲醇20mL、咪唑缓冲溶液80mL,混匀。
5.3标准品
盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸多西环素，含量均≥95%,具体见附录A。
5.4标准溶液制备
5.4.1 标准储备液(100pg/mL):分别准确称取适量标准品，用甲醇溶解稀释定容配制成土霉素、四环素、金霉素和多西环素浓度均为100μg/mL的标准储备液。-18 ℃以下避光储存，有效期1个月。
5.4.2混合标准中间液：分别准确移取土霉素、四环素、金霉素和多西环素标准储备液1.0mL、1.0mL、
2.0mL和2.0mL于100mL容量瓶，用甲醇稀释并定容，配制成土霉素、四环素、金霉素和多西环素浓度
分别为1.0μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL和2.0μg/mL的混合标准中间液。-18 ℃以下避光储存，有效期为7d。
5.5材料
5.5.1固相萃取柱：500 mg/6 mL,Oasis HLB或性能相当者。
5.5.2水相微孔滤膜：0.22μm。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。
6.2分析天平：感量0.01 g。
6.3分析天平：感量0.00001 g。
6.4 涡旋振荡器，
6.5离心机：转速6000 r/min或以上。
6.6 固相萃取装置(带负压抽滤器)。
6.7氮吹仪。
6.8 组织匀浆机。
7试样的制备与保存
7.1 试样的制备
按GB/T 30891-2014附录B的要求制样。
a) 取均质后的供试样品，作为供试试样；
b) 取均质后的空白样品，作为空白试样；
c)取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存。
8 测定步骤
8.1 提取
取试样5g(准确至±0.05g),加柠檬酸缓冲液20mL,涡旋震荡2 min,超声提取10 min,以6000 r/min离心10 min,取上清液于另一50mL离心管中。向残渣加柠檬酸缓冲液10 mL,重复提取2次，合并3次上清液，待净化。
8.2净化
将Oasis HLB固相萃取柱依次用甲醇10mL、水10mL、柠檬酸缓冲液5mL活化，移入待净化液，用甲醇溶液10mL,水10mL淋洗，抽干，加甲醇10mL洗脱，收集洗脱液，40℃氮气吹干，加磷酸二氢钾溶
液1.0mL溶解残渣，超声1min,过0.22μm水相微孔滤膜后，供高效液相色谱测定。
8.3 标准曲线的制备
准确移取土霉素、四环素、金霉素和多西环素混合标准中间溶液适量，用甲醇-咪唑缓冲溶液稀释成土霉素和四环素浓度分别为50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL,金霉素和多西环素浓度分别为100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、1000 ng/mL、2000ng/mL的混合标准系列工作溶液供高效液相色谱测定。以待测物峰面积为纵坐标、相应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。计算回归方程和相关系数。
8.4测定
8.4.1液相色谱参考条件
a) 色谱柱：Cu色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),或相当者；
b) 柱温：40℃;
c)进样量：30gL;
d) 流速：0.8mL/min;
e) 激发波长：380 nm;
f) 发射波长：520 nm;
g) 流动相：甲醇-咪唑缓冲溶液。
8.4.2测定法
取试样溶液和相应的标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积定量，外标法计算。标准工作液及试样溶液中土霉素、四环素、金霉素和多西环素响应值应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液的高效液相色谱图见附录B中的图B.1。
8.5空白试验
取空自试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测物残留量按标准曲线或公式(1)计算。
10检测方法的灵敏度、准确度和精密度
10.1 灵敏度
本方法在水产品可食组织中土霉素和四环素的检测限均为10.0μg/kg,多西环素和金霉素的检测限
均为20.0μg/kg;土霉素和四环素的定量限均为20.0μg/kg,多西环素和金霉素定量限均为40.0μg/kg。
10.2准确度
土霉素和四环素在20.0μg/kg～200μg/kg添加浓度的回收率为60%～110%;多西环素和金霉素在
40.0μg/kg～400 μg/kg添加浓度的回收率为60%～110%。
10.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%,批间相对标准偏差≤15%。
方法二 液相色谱-串联质谱法
11范围
本文件规定了水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量测定的液相色谱-串联质谱法。本文件适用于鱼、虾、蟹、鳖及海参等水产品可食组织中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定。
12规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 30891-2014 水产品抽样规范
13 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
14 原理
试样中残留的土霉素、四环素、金霉素和多西环素，用Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取，醋酸铅沉
淀，正己烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，以基质校正标准曲线进行外标法定量。
15试剂与材料
以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。
15.1 试剂
15.1.1乙腈(CH₃CN):色谱纯。
15.1.2 甲醇(CH₃OH):色谱纯。
15.1.3乙酸乙酯(CH₃COOC₂H₅):色谱纯。
15.1.4正己烷(C₅H₈):色谱纯。
15.1.5 甲酸(HCOOH):色谱纯。
15.1.6盐酸(HCD。
15.1.7氢氧化钠(NaOH)。
15.1.8柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O):优级纯。
15.1.9磷酸氢二钠(Na₂HPO₄):优级纯。
15.1.10乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O):优级纯。
15.1.11醋酸铅[Pb(CH₃COO)₂·3H₂O]。
15.2 溶液配制
15.2.1 Na₂EDTA-Mellvaine缓冲溶液(0.1mol/L):称取柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠10.9 g、乙二胺四
乙酸二钠37.2g,各自加水适量使溶解，混合，用水稀释至1000mL,用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH调节pH至4.0(±0.05)。
15.2.2醋酸铅溶液(20.0g/L):取醋酸铅20.0g,加水溶解并稀释至1000 mL。
15.2.3甲酸溶液(0.1%):取甲酸0.1mL,加水溶解并稀释至100mL。
15.2.4甲醇溶液：取甲醇5mL、水95mL,混匀。
15.2.5甲醇-乙酸乙酯：取甲醇10mL、乙酸乙酯90 mL,混匀。
15.2.6甲酸溶液(0.1%)-乙腈：取0.1%甲酸溶液90 mL、乙腈10mL,混匀。
15.3 标准品
盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸多西环素，含量均≥95%,具体见附录A。
15.4 标准溶液制备
15.......
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