GB 5413.37-2010 相关标准英文版PDF
| 标准号码 | 价格美元 | 第2步(购买) | 交付天数 | 标准名称 |
| GB 5413.37-2010 | 679 | GB 5413.37-2010 | [PDF]天数 <=3 | 食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | GB 5413.37-2010 (GB5413.37-2010) |
| 中文名称 | 食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定 |
| 英文名称 | National food safety standard -- Determination of aflatoxin M1 in milk and milk products |
| 行业 | 国家标准 |
| 中标分类 | C53;X16 |
| 国际标准分类 | 67.100.10 |
| 字数估计 | 17,145 |
| 发布日期 | 2010-03-26 |
| 实施日期 | 2010-06-01 |
| 旧标准 (被替代) | GB/T 18980-2003 |
| 引用标准 | GB/T 6682 |
| 采用标准 | ISO 14501-2007, NEQ |
| 标准依据 | 卫通(2010)7号;国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号 |
| 发布机构 | 中华人民共和国卫生部 |
| 范围 | 本标准规定了乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定方法。本标准第一法适用于乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定；第二法适用于乳、乳粉, 以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M1的测定；第三法适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的侧定；第四法适用于液态乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定。 |
GB 5413.37-2010
中华人民共和国国家标准
中华人民共和国卫生部 发布
2010-03-26 发布
2010-06-01 实施
食品安全国家标准
乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定
National food safety standard
前言
本标准第一法对应于ISO 14501：2007 Milk and milk powder-determination of aflatoxin M1 content
-clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by high-performance liquid chromatography，
本标准第一法与ISO 14501：2007的一致性程度为非等效；本标准第二法和第三法代替GB/T 18980-2003；
本标准第四法来自于NY/T 1664-2008《牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测 双流向酶联免疫法》。
本标准附录A和附录B为资料性附录。
食品安全国家标准
乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定
1 范围
本标准规定了乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1 的测定方法。
标准第一法适用于乳和乳制品中黄曲霉毒素 M1的测定；第二法适用于乳、乳粉，以及低脂乳、脱
脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素 M1 的测定；第三法适用于乳和乳粉中黄曲霉毒素 M1的测定；
第四法适用于液态乳和乳粉中黄曲霉毒素 M1 的测定。
2 规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本
适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
第一法 免疫亲和层析净化 液相色谱-串联质谱法
3 原理
试样液体或固体试样提取液经均质、超声提取、离心，取上清液经免疫亲和柱净化，洗脱液经氮气
吹干，定容，微孔滤膜过滤，经液相色谱分离，电喷雾离子源离子化，多反应离子监测（MRM）方式
检测。基质加标外标法定量。
4 试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
4.1 甲酸（HCOOH）。
4.2 乙腈 (CH3CN)：色谱纯。
4.3 石油醚（CnH2n+2）：沸程为30 ℃～60 ℃。
4.4 三氯甲烷（CHCl3）。
4.5 氮气：纯度≥99.9 %。
4.6 黄曲霉毒素M1标准样品：纯度≥98%。
4.7 乙腈-水溶液(1+4)：在400 mL水中加入100 mL乙腈。
4.8 乙腈-水溶液(1+9)：在450 mL水中加入50 mL乙腈。
4.9 0.1 % 甲酸水溶液：吸取1 mL 甲酸（4.1），用水稀释至1000 mL。
4.10 乙腈-甲醇溶液（50+50）：在500 mL乙腈中加入500 mL甲醇。
4.11 氢氧化钠溶液（0.5 mol/L）：称取2 g氢氧化钠溶解于100 mL水中。
4.12 空白基质溶液
分别称取与待测样品基质相同的、不含所测黄曲霉毒素的阴性试样8份于100 mL烧杯中。以下操作
按6.1试液提取和6.2 净化步骤进行。合并所得8份试样的纯化液，用0.22 μm 微孔滤膜的一次性滤头
（5.23）过滤。弃去前0.5 mL滤液，接取少量滤液供液相色谱-质谱联用仪检测。
获得色谱-质谱图后，对照附录 A 中的图 A.2，在相应的保留时间处，应不含黄曲霉毒素 M1。剩
余滤液转移至棕色瓶中，在-20 ℃电冰箱内保存，供配制标准系列溶液使用。
4.13 黄曲霉毒素M1标准储备溶液：分别称取标准品黄曲霉毒素M1 0.10 mg（精确至0.01 mg），用三氯
甲烷（4.4）溶解定容至10 mL。此标准溶液浓度为0.01 mg/mL。溶液转移至棕色玻璃瓶中后，在-20 ℃
电冰箱内保存，备用。
4.14 黄曲霉毒素M1标准系列溶液：吸取黄曲霉毒素M1 标准储备溶液（4.13）10 µL于10 mL容量瓶中，
用氮气将三氯甲烷吹至近干，空白基质溶液（4.12）定容至刻度，所得浓度为10 ng/mL的M1标准中间溶
液。再用空白基质溶液（4.12）将黄曲霉毒素M1标准中间溶液稀释为0.5 ng/mL、0.8 ng/mL、1.0 ng/mL、
2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、6.0 ng/mL、8.0 ng/mL的系列标准工作液。
5 仪器和设备
5.1 液相色谱-质谱联用仪，带电喷雾离子源。
5.2 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T31，柱长100 mm，柱内径2.1 mm；填料粒径1.8 μm，或同等性
能的色谱柱。
5.3 天平：感量为0.001 g和0.00001 g。
5.4 匀浆器。
5.5 超声波清洗器。
5.6 离心机：转速≥6000 转/分钟。
5.7 50 mL具塞PVC离心管。
5.8 水浴:温控30 ℃士2 ℃，50 ℃士2 ℃，温度范围25 ℃～60 ℃。
5.9 容量瓶:100 mL。
5.10 玻璃烧杯:250 mL，50 mL。
5.11 带刻度的磨口玻璃试管:5 mL，10 mL，20 mL。
5.12 移液管:1.0 mL，2.0 mL和50.0 mL。
5.13 玻璃棒。
5.14 10目圆孔筛。
5.15 250 mL分液漏斗。
5.16 100 mL圆底烧瓶。
5.17 旋转蒸发仪。
1给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这
些等效的产品。
5.18 pH计：精度为0.01。
5.19 250 mL具塞锥形瓶。
5.20 免疫亲和柱：针筒式 3 mL。
5.21 10 mL和50 mL一次性注射器。
5.22 固相萃取装置（带真空系统）。
5.23 一次性微孔滤头：带0.22 μm微孔滤膜（水相系）。
6 分析步骤
6.1 试液提取
6.1.1 乳：称取50 g(精确至0.01 g)混匀的试样，置于50 mL具塞离心管(5.7)中，在水浴(5.8) 中加热
到35℃～37 ℃。在6000 转/分钟下离心15 min。收集全部上清液，供净化用。
6.1.2 发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)：称取50 g(精确至0.01 g)混匀的试样，用0.5 mol/L 的
氢氧化钠溶液（4.11）在酸度计(5.18)指示下调pH至7.4，在 9500 转/分钟下匀浆(5.4)5 min，以下按 6.1.1
进行操作。
6.1.3 乳粉和粉状婴幼儿配方食品：称取 10 g(精确至0.01 g)试样，置于250 mL 烧杯中。将50 mL 已
预热到50 ℃的水加入到乳粉中，用玻璃棒将其混合均匀。如果乳粉仍未完全溶解，将烧杯置于50℃的
水浴(5.8)中放置30 min。溶解后冷却至20 ℃，移入100 mL 容量瓶中，用少量的水分次洗涤烧杯，洗涤
液一并移入容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀后分别移至两个50 mL离心管(5.7)中，在6000转/分钟下
离心15 min，混合上清液，用移液管移取50mL上清液供净化处理用。
6.1.4 干酪：称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管(5.7)中，加
2 mL水和30 mL甲醇，在9500 转/分钟下匀浆5 min，超声提取30 min，在6000 转/分钟下离心15 min。
收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚（4.3），振摇2 min，待分层后，
将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，
减压浓缩至约2 mL，浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4)（4.7）5 mL分2次洗涤，洗涤液一
并倒入50 mL离心管中，加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。
6.1.5 奶油：称取5g(精确至0.01 g)试样，置于50 mL烧杯中，用20 mL石油醚(4.3)将其溶解并移于
250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中，待分层后，
将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪（5.17）中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50
mL，供净化处理。
6.2 净化
6.2.1 免疫亲和柱的准备
将一次性的50 mL注射器筒与亲和柱(5.20)上顶部相串联，再将亲和柱与固相萃取装置连接起来。
注：根据免疫亲和柱的使用说明书要求，控制试液的pH值。
6.2.2 试样的纯化
将以上 6.1 试液提取液移至 50 mL 注射器筒(5.21)中，调节固相萃取装置的真空系统,控制试样以 2
mL/分钟～3 mL/分钟稳定的流速过柱。取下 50 mL 的注射器筒，装上 10 mL 注射器筒。注射器筒内加
入水，以稳定的流速洗柱，然后，抽干亲和柱。脱开真空系统，在亲和柱下部放入 10 mL 刻度试管，
上部装上另一个 10 mL 注射器筒，加入 4 mL 乙腈(4.2),洗脱黄曲霉毒素 M1，洗脱液收集在刻度试管中
(5.11)中，洗脱时间不少于 60 秒。然后用氮气缓缓地在 30 ℃下将洗脱液蒸发至近干 (如果蒸发至干，
会损失黄曲霉毒素 M1)，用乙腈-水溶液（1+9）稀释至 1 mL。
6.3 液相色谱参考条件
流动相：A 液，0.1% 甲酸溶液；B 液，乙腈-甲醇溶液（1+1）。
梯度洗脱：参见附录A中的表A.1。
流动相流动速度：0.3 mL/min。
柱温：35 ℃。
试液温度：20 ℃。
进样量：10 µL。
6.4 质谱参考条件
检测方式：多离子反应监测（MRM），详见表1中母离子、子离子和碰撞能量。扫描图参见附录A
中的图A.1。
表1 离子选择参数表
黄曲霉毒素 母离子 定量子离子 碰撞能量 定性子离子 碰撞能量 离子化方式
M1 329.0 273.5 22 259.5 22 ESI+
离子源控制条件：参见附录A中的表A.2。
6.5 定性
试样中黄曲霉毒素 M1 色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5
％之内。
黄曲霉毒素 M1 的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于 3（S/N≥3），定量离子的重构离
子色谱峰的信噪比应大于等于 10（S/N≥10）。
每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，
对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差
不超过表 2 规定的范围。
表 2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 ＞50％ ＞20％至 50％ ＞10％至 20％ ≤10％
允许相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50%
各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的 LC-MS/MS
色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合
物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于 20%），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子
对应 LC-MS/MS 色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。
6.6 试样测定
按照 6.3 和 6.4 确立的条件，测定试液（6.2）和标准系列溶液（4.14）中黄曲霉毒素 M1 的离子
强度，外标法定量。色谱图见附录 A 的图 A.2。
色谱参考保留时间：黄曲霉毒素 M1 3.23 min。
6.7 空白试验
不称取试样，按6.5的步骤做空白实验。应确认不含有干扰被测组分的物质。
6.8 标准曲线绘制
将标准系列溶液（4.14）由低到高浓度进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。
6.9 定量测定
待测样液中被测组分的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围时，则应将样液用空白基质
溶液稀释后重新进样分析或减少取样量，重新按6.1进行处理后再进样分析。
7 分析结果的表述
外标法定量，按式（1）计算黄曲霉毒素M1的残留量。
式中:
X--试样中黄曲霉毒素 M1 的含量，单位为微克每千克（µg/kg）；
A--试样中黄曲霉毒素 M1 的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
V--样品定容体积，单位毫升（mL）；
f--样液稀释因子；
m--试样的称样量，单位克（g）。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
8 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10 %。
第二法 免疫亲和层析净化高效液相色谱法
9 原理
亲和柱内含有的黄曲霉毒素 M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上，当试样通过亲和柱时，抗
体选择性的与黄曲霉毒素 M1(抗原)键合，形成抗体-抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质，然后用洗
脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素 M1，收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液
中黄曲霉毒素 M1 含量。
10 试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。
10.1 免疫亲和柱：亲和柱的最大容量不小于100 ng黄曲霉毒素M1(相当于50 mL浓度为2 µg/L的试样)，
当标准溶液含有4 ng黄曲霉毒素M1(相当于50 mL浓度为80 ng/L的试样)时回收率不低于80 %。应该定期
检查亲和柱的柱效和回收率，对于每个批次的亲和柱至少检查一次(见10.1.1和10.1.2)。
10.1.1 柱效检查
用移液管(11.4)移取 1.0 mL 的黄曲霉毒素 M1 标准储备液(10.5.2)到 20 mL 的锥形试管中(11.9)。
用恒流的氮气(10.3)将液体慢慢吹干，然后用 10 mL l0 %的乙腈水溶液(10.2.2)溶解残渣，用力摇荡。
将该溶液加入到 40 mL 的水中，充分混匀，全部通过免疫亲和柱（10.1）。按说明书要求使用免疫
亲和柱。淋洗免疫亲和柱后，洗脱黄曲霉毒素 M1。将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定
免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素 M1 含量。
计算黄曲霉毒素 M1 的回收率，将其结果与 10.1 中所要求的指标进行比较。
10.1.2 回收率检查
用移液管(11.4)移取 0.8 mL 0.005 µg/mL 的黄曲霉毒素 M1 标准工作液(10.5.3)到 10 mL 的水中，
充分混匀，全部通过免疫亲和柱。按说明书使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱，洗脱下黄曲霉毒素 M1。
将洗脱液进行适当稀释后，用高效液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素 M1 含量。计算黄曲霉
毒素 M1 的回收率，将其结果与 10.1 中所要求的指标进行对比。
10.2 乙腈(CH3CN)：色谱纯。
10.2.1 25 %乙腈水溶液：将250 mL的乙腈(10.2)与750 mL的水混溶(使用前需要脱气)。
10.2.2 10 %乙腈水溶液：将100 mL的乙腈(10.2)与900 mL的水混溶(使用前需要脱气)。
10.3 氮气（N2）。
10.4 三氯甲烷：加入0.5 %～1.0 %质量比(与三氯甲烷质量比)的乙醇进行稳定。
10.5 黄曲霉毒素M1标准溶液，纯度≥98%。
10.5.1 浓度的校正
黄曲霉毒素 M1 三氯甲烷标准溶液浓度为 10 µg/mL。根据下面的方法，在最大吸收波段处测定溶液
的吸光度，以确定黄曲霉毒素 M1 的实际浓度。
用分光光度计（11.11）在 340 nm～370 nm 处测定，扣除三氯甲烷的空白本底，读取标准溶液的吸
光度值。在接近 360 nm 最大吸收波段 λmax 处，测得吸光度值为 A，根据式（2）计算浓度值：
式中：
ci--黄曲霉毒素 M1实际浓度，单位为微克每毫升 (µg/mL)；
A--在λmax处测得的吸光度值；
M--328 g/mol，黄曲霉毒素 M1 摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol）；
ε--19950，溶于三氯甲烷中的黄曲霉毒素 M1的吸光系数，单位为平方米每摩尔（m2/mol）。
10.5.2 标准储备液
确定黄曲霉毒素 M1 标准溶液的实际浓度值后（10.5.1），继续用三氯甲烷将其稀释为浓度为 0.1
µg/mL 的储备液。储备液密封后于冰箱中 5 ℃以下避光保存。在此条件下，储备液可以稳定两个月。
10.5.3 黄曲霉毒素M1标准工作液
从冰箱中取出标准储备液（10.5.2）放置至室温，移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工
作液临用前配制。
黄曲霉毒素 M1 标准工作液配制：用移液管（11.4）准确移取 1.0 mL 的储备液（10.5.2）到 20 mL
的锥形试管中（11.9），用和缓的氮气（10.3）将溶液吹干，然后用 20.0 mL10 %的乙腈水溶液（10.2.2）
将残渣重新溶解，30 min 内振摇，混匀，配成浓度为 0.005 µg/mL 的黄曲霉毒素 M1 标准工作液。在用
氮气对储备液吹干的过程中，一定要仔细操作，避免因温度降低太多而出现结露。
在作标准曲线时，黄曲霉毒素 M1 的进样绝对含量分别是 0.05 ng、0.1 ng、0.2 ng、0.4 ng。根据高
效液相色谱仪进样环的容积量，用工作液配置一系列适当浓度的黄曲霉毒素 M1 标准溶液，稀释液用 10
%乙腈水溶液（10.2.2）。
11 仪器和设备
11.1 一次性注射器：10 mL和50 mL。
11.2 真空系统。
11.3 离心机：转速≥7000 转/分钟。
11.4 移液管：1.0 mL、2.0 mL和50.0 mL。
11.5 玻璃烧杯：250 mL。
11.6 容量瓶：100 mL。
11.7 水浴：温控30 ℃± 2℃，50 ℃±2 ℃，温度范围36℃±1 ℃。
11.8 滤纸：中速定性滤纸。
11.9 带刻度的磨口锥形玻璃试管：5 mL、10 mL、20 mL。
11.10 高效液相色谱仪
11.10.1 无脉冲泵：适合恒定体积流量约1 mL/min的泵。
11.10.2 进样系统：具有固定或可变容积的进样环，进样体积50 µL～500 µL。
11.10.3 反相色谱柱：填充3 μm或者5 μm的十八烷基硅胶，加有填充反相材料的保护柱。
11.10.4 荧光检测器：具有365 nm激发波长、435 nm发射波长，在适当的色谱条件下能够测定0.02 ng
的黄曲霉毒素M1(相当于5倍噪音)。
11.11 紫外分光光度计：波长范围为200 nm～400 nm。
11.12 天平：感量为0.01 g。
12 分析步骤
所有的操作分析均应在避光条件下进行。
12.1 试样制备
12.1.1 乳：将试样在水浴（11.7）中加热到35℃～37℃。用滤纸（11.8）过滤（根据情况，可以使用多
层滤纸进行过滤），或者在7000 转/分钟离心15 min。至少收集50 mL试样，按照12.4继续操作。
12.1.2 乳粉：称取10 g样品（精确到0.1 g），置于250 mL的烧杯（11.5）中。将50 mL已预热到50℃的
水多次少量地加入到乳粉中，用搅拌棒将其混合均匀。如果乳粉不能完全溶解，将烧杯在50℃的水浴
（11.7）中放置至少30 min,仔细混匀。将溶解的乳粉冷却至20℃后，移入100 mL容量瓶（11.......