| 标准编号 | GB/T 38477-2020 (GB/T38477-2020) | | 中文名称 | 基因表达的测定 蛋白印迹法 | | 英文名称 | Determination of gene expression - Western blot | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A21 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 10,125 | | 发布日期 | 2020-11-19 | | 实施日期 | 2020-11-19 | | 标准依据 | 国家标准公告2020年第26号 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 38477-2020
Determination of gene expression - Western blot
ICS 07.080
A21
中华人民共和国国家标准
基因表达的测定 蛋白印迹法
2020-11-19发布
2020-11-19实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位:河北医科大学、中国标准化研究院、河北省食品检验研究院、中国科学院遗传与发
育生物学研究所农业资源研究中心、中国医科大学、河北师范大学。
本标准主要起草人:吕品、马爱进、张岩、赵伟东、曹鹏秀、赵美丞、王宁。
基因表达的测定 蛋白印迹法
1 范围
本标准规定了用蛋白印迹(Westernblot)法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测
定步骤和结果分析。
本标准适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
基因表达 geneexpression
将储存在DNA分子中的遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)
TBS:Tris缓冲盐溶液(TrisBufferedSaline)
4 原理
SDS-PAGE分离的蛋白质转移到转印膜上后,先用抗目的蛋白质的一抗与转印膜上的蛋白质反
应,然后利用带标记的二抗与一抗反应,最后根据二抗标记物的特性,检测微量蛋白质。
5 试剂或材料
5.1 总则
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
5.2 水
GB/T 6682,二级。
5.3 1mol/LTris-盐酸溶液
称取12.1gTris加入80mL水溶解,用盐酸调至所需pH,加水定容至100mL。
5.4 2mol/L氯化钠溶液
将117g氯化钠加水溶解,定容至1000mL。
5.5 0.5mol/L乙二胺四乙酸溶液
称取18.61g乙二胺四乙酸二钠二水合物,加入80mL水,充分搅拌,用氢氧化钠调pH至8.0,然
后定容至100mL。
5.6 动物细胞/组织总蛋白裂解液
取5mL1mol/LTris-盐酸溶液(pH8.0)、7.5mL2mol/L氯化钠溶液、1mL0.5mol/L乙二胺
四乙酸溶液、1mL乙基苯基聚乙二醇、0.1g十二烷基硫酸钠、1g脱氧胆酸钠、加水定容至100mL。使
用前加入蛋白酶抑制剂。
5.7 植物总蛋白抽提试剂盒
含裂解液和蛋白酶抑制剂。
5.8 1.5mol/LTris-盐酸(pH8.8)溶液
将18.15gTris加入80mL水溶解,用1mol/L盐酸调pH至8.8,加水定容至100mL。
5.9 丙烯酰胺溶液
称取29g丙烯酰胺单体和1gN,N'-甲叉双丙烯酰胺,加水溶解并定容至100mL,过滤,置于棕色
瓶,4℃避光保存,2个月内使用。
5.10 0.1g/mL十二烷基硫酸钠溶液
称取10g十二烷基硫酸钠,加水溶解并定容至100mL,室温保存。
5.11 0.1g/mL过硫酸铵溶液
称取1g过硫酸铵,加水溶解并定容至10mL,分装后,于-20℃保存。
5.12 蛋白浓度测定试剂盒
含蛋白质标准品BSA和染料试剂。
5.13 5×SDS上样缓冲液
取2.5mL1mol/LTris-盐酸(pH6.8)缓冲液、2g十二烷基硫酸钠、1.2mLβ-巯基乙醇、4mL甘
油、0.2g溴酚蓝加入水中溶解,定容至40mL。
5.14 5×SDS-PAGE电泳缓冲液
称取23.5g甘氨酸和3.775gTris,加水溶解,定容至250mL。使用时按如下比例稀释至使用浓
度:取133mL5×SDS-PAGE电泳缓冲液,7mL0.1g/mL十二烷基硫酸钠溶液,加水定容至700mL。
5.15 转膜缓冲液
称取3.03gTris,14.4g甘氨酸,加水溶解,再加200mL甲醇混匀,定容至1L,4℃保存。
5.16 TBS溶液
量取75mL2mol/L氯化钠溶液和10mL1mol/LTris-盐酸(pH7.5)缓冲液,加水定容至1L。
5.17 TBST溶液
量取75mL2mol/L氯化钠溶液、10mL1mol/LTris-盐酸(pH7.5)缓冲液和1mL吐温-20,加
水定容至1L。
5.18 封闭液
称取5g脱脂奶粉,溶于100mLTBST溶液,混匀,现用现配。
6 仪器设备
6.1 电泳仪。
6.2 转膜仪。
6.3 垂直电泳槽。
6.4 分析天平,感量0.001g。
6.5 平板摇床。
6.6 低温离心机,最大离心力25910g。
6.7 化学发光仪/红外荧光成像系统。
6.8 振荡器。
6.9 真空干燥器。
6.10 2.45mm超厚滤纸。
6.11 1.5mL离心管。
6.12 磁力搅拌器。
7 测定步骤
7.1 总蛋白的提取
7.1.1 动物总蛋白的提取
将20mg体外培养的细胞或研碎的组织转移至1.5mL的离心管中,加150μL~250μL预冷的细胞裂
解液(含蛋白酶抑制剂),振荡器震荡15s,冰浴5min,重复震荡-冰浴30min后,4℃,12000r/min离心
10min,得上清液。
7.1.2 植物总蛋白的提取
按照植物总蛋白提取试剂盒说明进行。
7.2 蛋白浓度的测定
按照蛋白浓度测定试剂盒说明进行。
7.3 SDS-PAGE
7.3.1 蛋白变性
测完蛋白浓度后,计算含100μg总蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品于离心管中,加入
5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×,将样品于沸水中煮3min~5min使蛋白质变性。
7.3.2 制胶
根据蛋白质相对分子质量大小选择相应的SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度,参见附录A。
7.3.3 上样
取7.3.1的蛋白样品上样,相邻齿道加上标准分子量预染蛋白,空余齿道用1×上样缓冲液补足
体积。
7.3.4 电泳
选择电压为8V/cm,当染料进入分离胶后,把电压提高到15V/cm,继续电泳直到溴酚蓝达到分离
胶底部,然后关闭电源。
7.4 转膜
7.4.1 凝胶准备
将进行完SDS-PAGE后的凝胶浸泡于转膜缓冲液中30min。
7.4.2 半干法转移蛋白质
将转印膜和两张与转印膜相同尺寸的滤纸于转膜缓冲液中浸泡5min。由下至上安装转移装置:
阳极板-超厚滤纸-转印膜-凝胶-超厚滤纸-阴极板,根据凝胶面积按0.65mA/cm2 接通电流,根
据目的蛋白相对分子量大小,转移1.5h~3h。
7.5 封闭
将转印膜置于封闭液中,室温摇动1h。
7.6 免疫反应
将封闭后的转印膜转移到一抗工作液中,室温下摇动1h以上或4℃缓慢摇动过夜。弃去一抗工
作液,用TBST摇动洗涤转印膜3次,每次10min,最后用TBS摇动洗涤转印膜5min。
将转印膜置于二抗工作液中,室温下摇动1h~3h。弃去二抗工作液,以TBST摇动洗涤转印膜
3次,每次1......
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