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| 标准编号 | GB 5009.285-2022 (GB5009.285-2022) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定 | | 英文名称 | National food safety standard - Determination of Vitamin B12 in foods | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 20,271 | | 发布日期 | 2022-06-30 | | 实施日期 | 2022-12-30 | | 旧标准 (被替代) | GB 5413.14-2010 | | 归口单位 | 国家健康卫生委员会 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局 | GB 5009.285-2022: 食品安全国家标准 食品中维生素B12的测定
GB 5009.285-2022 英文名称: National food safety standard - Determination of Vitamin B12 in foods
１ 范围
本标准规定了食品中维生素Ｂ１２的测定方法。
第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品中维生素Ｂ１２的测定。
第二法液相色谱-质谱法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品、肉及肉制品、即食谷物、烘焙食品、果冻、
饮料中维生素Ｂ１２的测定。
第三法微生物法适用于婴幼儿食品、乳及乳制品中维生素Ｂ１２的测定。
第一法 液相色谱法
２ 原理
试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和５-脱氧腺苷钴胺
素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，紫外检测器检测，外
标法定量。
３ 试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T ６６８２规定的一级水。
３．１ 试剂
３．１．１ 无水乙酸钠（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）。
３．１．２ 乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）。
３．１．３ 甲醇（ＣＨ３ＯＨ）：色谱级。
３．１．４ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱级。
３．１．５ 三氟乙酸（ＣＦ３ＣＯＯＨ）：色谱级。
３．１．６ 氰化钾或氰化钠（ＫＣＮ／ＮａＣＮ）。
３．１．７ 胃蛋白酶（ＣＡＳ号：９００１-７５-６，活力≥４００Ｕ／ｍｇ）。
３．１．８ 淀粉酶（活力≥５０Ｕ／ｍｇ）。
３．１．９ 乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。
３．２ 试剂配制
３．２．１ 乙醇溶液（２５％）：量取２５０ｍＬ乙醇，加水稀释至１０００ｍＬ，混匀。
３．２．２ 乙酸钠缓冲液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：称取２０．５ｇ无水乙酸钠，用９５０ｍＬ水溶解并用乙酸调ｐＨ至４．０±０．１，用水稀释至１０００ｍＬ。
３．２．３ 氰化钾（或氰化钠）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）：称取１．０ｇ氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用水
稀释至１００ｍＬ。
注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品；操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或
使用。
３．２．４ 三氟乙酸溶液（０．０４％，体积比）：量取５００ｍＬ水，加入２００μＬ三氟乙酸，混匀。
３．３ 标准品
维生素Ｂ１２（氰钴胺素）标准品（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ号：６８-１９-９）：纯度≥９９％，或经国家认证并
授予标准物质证书的标准品。
３．４ 标准溶液配制
３．４．１ 维生素Ｂ１２标准储备液（１ｍｇ／ｍＬ）：称取１０ｍｇ（精确至０．０１ｍｇ）维生素Ｂ１２标准品于５０ｍＬ烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂瓶，
于-２０℃下避光保存，有效期６个月。
３．４．２ 维生素Ｂ１２标准工作液（１０μｇ／ｍＬ）：吸取１．００ｍＬ维生素Ｂ１２标准储备液，置于１００ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存，有效期１个月。
３．４．３ 维生素Ｂ１２标准系列工作溶液：准确吸取标准工作液３０μＬ、６０μＬ、９０μＬ、１５０μＬ和２００μＬ，分别置于１０ ｍＬ 容量瓶中，用水定容至刻度。其浓度分别为：３０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、
１５０ｎｇ／ｍＬ和２００ｎｇ／ｍＬ。临用现配。
３．５ 材料
３．５．１ 维生素Ｂ１２免疫亲和柱，柱容量≥８００ｎｇ，柱回收率≥８５％（验证方法参见附录Ａ）。
３．５．２ 玻璃纤维滤纸。
３．５．３ 微孔滤膜：水相，０．２２μｍ。
４ 仪器和设备
４．１ 液相色谱仪：带紫外检测器。
４．２ 天平：感量为０．０１ｇ、０．００１ｇ和０．００００１ｇ。
４．３ ｐＨ 计：精度０．０１。
４．４ 水浴恒温振荡器：温度范围２５℃～１００℃。
４．５ 超声波清洗器。
４．６ 离心机：转速≥１００００ｒ／ｍｉｎ。
５ 分析步骤
注：操作过程应避免紫外光照，并尽可能避光操作。
５．１ 样品前处理
５．１．１ 试样制备
固体样品粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品试验前振摇混匀。
５．１．２ 样品提取
称取５ｇ～１０ｇ试样（精确至０．０１ｇ）于１５０ｍＬ具塞锥形瓶中，依次加入３０ｍＬ乙酸钠缓冲液、
０．２ｇ胃蛋白酶、０．０５ｇ淀粉酶和２ｍＬ氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在３７℃，酶解３０ｍｉｎ（肉类样品酶解１０ｈ～１６ｈ），酶解后转入１００℃水浴中，保持３０ｍｉｎ，取出
冷却至室温。将样品溶液转移至１００ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。移取上述溶液４０ｍＬ至
５０ｍＬ离心管中，在１００００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。
注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的样品，在样品提取时可不使用氰化钾（或氰
化钠）。
５．１．３ 净化
将免疫亲和柱连接至固相萃取装置上，弃去免疫亲和柱内的缓冲液后，移取适量上述滤液（其中含
维生素Ｂ１２为１０ｎｇ～５００ｎｇ）过柱，调节过柱速度为２ｍＬ／ｍｉｎ～３ｍＬ／ｍｉｎ。待样液完全过柱后，用
１０ｍＬ水以稳定流速淋洗免疫亲和柱，抽干。在免疫亲和柱下放置１０ｍＬ玻璃试管，用３ｍＬ甲醇分
３次洗脱，收集全部洗脱液，在６０℃以下用氮气流缓缓吹至近干，用０．０４％三氟乙酸溶液定容至
１．０ｍＬ，涡旋３０ｓ溶解残留物，０．２２μｍ滤膜过滤，待测。注：氰化钾（或氰化钠）废液严禁与酸混合，可加入氢氧化钠调节ｐＨ＞１０，再加入高锰酸钾粉末（按废液质量的３％
加入），使氰化物分解，放置２４ｈ后排放。
５．２ 液相色谱参考条件
５．２．１ 色谱柱：Ｃ１８柱（柱长１５０ｍｍ，柱内径４．６ｍｍ，填料粒径２．５μｍ），或相当者。５．２．２ 流动相：Ａ相，０．０４％三氟乙酸溶液；Ｂ相，乙腈。
５．２．３ 梯度洗脱：０ｍｉｎ～６．０ｍｉｎ，９０％ Ａ；６．０ｍｉｎ～８．５ｍｉｎ，９０％～０％ Ａ；８．５ｍｉｎ～１４．０ｍｉｎ，９０％ Ａ。
５．２．４ 流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ。
５．２．５ 柱温：４０℃。
５．２．６ 进样体积：１００μＬ。５．２．７ 检测波长：３６１ｎｍ。
５．３ 标准曲线的制作
将标准系列溶液由低浓度到高浓度依次注入液相色谱仪中，测定相应的色谱峰面积，以维生素Ｂ１２的峰面积为纵坐标，以维生素Ｂ１２的浓度为横坐标绘制标准曲线。液相色谱图见附录Ｂ中图Ｂ．１。
５．４ 样品测定
将待测样液注入液相色谱仪中，得到待测溶液中维生素Ｂ１２的峰面积，根据标准曲线得到测定液中维生素Ｂ１２的浓度。待测样液中维生素Ｂ１２的响应值应在标准曲线的线性范围内，超过线性范围则应稀释上机溶液，或调整取样量重新按样品分析步骤处理后再进样分析。
５．５ 空白试验
不称取试样，按样品分析步骤操作，应不含有干扰待测组分的物质。
６ 分析结果的表述
试样中维生素Ｂ１２（以氰钴胺素计）的含量按式（１）计算：
计算结果保留两位有效数字。
７ 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的１５％。
８ 其他
当取样量为５．００ｇ时，婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品的检出限为０．２μｇ／１００ｇ，定量限为０．５μｇ／１００ｇ。
第二法 液相色谱-质谱法
９ 原理
试样经酶解后，用氰化钾（或氰化钠）溶液将钴胺素异构体（羟钴胺素、甲钴胺素和５-脱氧腺苷钴胺
素等）转化为氰钴胺素。样液通过免疫亲和柱净化、浓缩后，反相液相色谱柱分离，串联质谱检测，同位
素内标法定量。
１０ 试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T ６６８２规定的一级水。
１０．１ 试剂
１０．１．１ 无水乙酸钠（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）。
１０．１．２ 氢氧化钠（ＮａＯＨ）。
１０．１．３ 乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）。
１０．１．４ 乙腈（ＣＨ３ＣＮ）：色谱纯。
１０．１．５ 乙酸铵（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）：色谱纯。
１０．１．６ 氰化钾或氰化钠（ＫＣＮ／ＮａＣＮ）。
１０．１．７ 胃蛋白酶（ＣＡＳ号：９００１-７５-６，活力≥４００Ｕ／ｍｇ）。
１０．１．８ 淀粉酶（活力≥５０Ｕ／ｍｇ）。
１０．１．９ 乙醇（Ｃ２Ｈ６Ｏ）。
１０．２ 试剂配制
１０．２．１ 乙醇溶液（２５％）：量取２５０ｍＬ乙醇，加水稀释至１０００ｍＬ，混匀。
１０．２．２ 乙酸钠缓冲液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：称取２０．５ｇ无水乙酸钠，用９５０ｍＬ水溶解并用乙酸调ｐＨ至４．０
±０．１，用水稀释至１０００ｍＬ。
１０．２．３ 氰化钾（或氰化钠）溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）：称取１．０ｇ氰化钾（或氰化钠）固体，加适量水溶解，并用
水稀释至１００ｍＬ。
注：氰化钾（或氰化钠）为剧毒化学品，操作者须带防护用具，在通风橱内进行氰化钾（或氰化钠）溶液的配制或
使用。
１０．２．４ 氢氧化钠溶液（１ｍｏｌ／Ｌ）：称取４．０ｇ氢氧化钠，加适量水溶解，并用水稀释至１００ｍＬ。
１０．２．５ 乙酸铵溶液（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）：称取０．１９ｇ乙酸铵，加适量水溶解，并用水稀释至１０００ｍＬ。
１０．２．６ 乙腈溶液（９０％，体积比）：量取１００ｍＬ水加于９００ｍＬ乙腈中，混匀，超声脱气。
１０．３ 标准品
１０．３．１ 维生素Ｂ１２（氰钴胺素）标准品（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ，ＣＡＳ号：６８-１９-９）：纯度≥９９％，或经国家认
证并授予标准物质证书的标准品。
１０．３．２ 维生素Ｂ１２同位素内标溶液（１３Ｃ７-Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１４Ｏ１４Ｐ）：１μｇ／ｍＬ甲醇溶液。
１０．４ 标准溶液配制
１０．４．１ 维生素Ｂ１２标准储备溶液（１ｍｇ／ｍＬ）：称取１０ｍｇ（精确至０．０１ｍｇ）维生素Ｂ１２标准品于５０ｍＬ
烧杯中，用乙醇溶液溶解后，转移至１０ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，转移至棕色试剂
瓶，于-２０℃下避光保存，有效期６个月。
１０．４．２ 维生素Ｂ１２标准中间溶液（１０μｇ／ｍＬ）：吸取１．００ｍＬ维生素Ｂ１２标准储备溶液，置于１００ｍＬ容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存，有效期１个月。
１０．４．３ 维生素Ｂ１２标准工作溶液（０．２μｇ／ｍＬ）：吸取１．００ｍＬ维生素Ｂ１２标准中间溶液，置于５０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存，有效期一周。
１０．４．４ 维生素 Ｂ１２同位素内标工作液（５０ｎｇ／ｍＬ）：吸取０．５ｍＬ 维生素 Ｂ１２同位素内标溶液
（１μｇ／ｍＬ），置于１０ｍＬ容量瓶中，用水定容至刻度。转移至棕色试剂瓶中，于４℃下避光保存。１０．４．５ 标准系列溶液：分别准确移取０．２μｇ／ｍＬ的维生素Ｂ１２标准工作溶液１０μＬ、２５μＬ、５０μＬ、１２５μＬ、２５０μＬ和５００μＬ于１ｍＬ容量瓶中，各加入１００μＬ同位素内标工作液（５０ｎｇ／ｍＬ），用水定容至刻度，摇匀。其中，维生素Ｂ１２的浓度分别为２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ和
１００ｎｇ／ｍＬ。维生素Ｂ１２同位素内标的浓度为５ｎｇ／ｍＬ。临用现配。
１０．５ 材料
１０．５．１ 维生素Ｂ１２免疫亲和柱，柱容量≥８００ｎｇ，柱回收率≥８５％（验证方法参见附录Ａ）。
１０．５．２ 玻璃纤维滤纸。
１０．５．３ 微孔滤膜：水相，０．２２μｍ。
１１ 仪器和设备
１１．１ 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源（ＥＳＩ）。
１１．２ 天平：感量为０．０１ｇ、０．００１ｇ和０．００００１ｇ。
１１．３ ｐＨ计：精度０．０１。
１１．４ 水浴恒温振荡器：温度范围２５℃～１００℃。
１１．５ 超声波清洗器。
１１．６ 离心机：转速≥１００００ｒ／ｍｉｎ。
１２ 分析步骤
注：操作过程应避免紫外光照射，并尽可能避光操作。
１２．１ 样品前处理
１２．１．１ 试样制备
固体样品需粉碎、研磨，或用绞肉机制成食糜，均质混匀。液体样品测定前振摇混匀。
１２．１．２ 提取
１２．１．２．１ 婴幼儿食品和乳品、肉与肉制品、烘焙食品、即食谷物
称取混匀后的试样１ｇ～５ｇ（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，依次加入１００μＬ同位素内标工作液、２５ｍＬ乙酸钠缓冲液、０．０４ｇ胃蛋白酶、０．０１ｇ淀粉酶和２ｍＬ氰化钾（或氰化钠）溶液，充分混合。
将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在３７℃下，振荡酶解３０ｍｉｎ（肉类样品需酶解１０ｈ～１６ｈ），酶解后转
入１００℃水浴中，保持３０ｍｉｎ，取出冷却至室温。在１００００ｒ／ｍｉｎ下离心１０ｍｉｎ，取上清液用玻璃纤维
滤纸过滤后备用。
１２．１．２．２ 饮料
称取混匀后的试样２５ｇ（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入１００μＬ同位素内标工作液，用氢氧化钠溶液调ｐＨ至５～７（碳酸饮料需在超声波振荡器中脱气１０ｍｉｎ后再调ｐＨ），......
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